[发明专利]一种单细胞外泌体静态检测试剂盒及检测分析方法

权利要求书

1.一种单细胞外泌体静态检测试剂盒，其特征在于，包括细胞表型分析用剂、外泌体检测用剂、微流控芯片组；所述细胞表型分析用剂包括特异性细胞保护荧光染剂和细胞缓冲液；所述外泌体检测用剂包括外泌体检测抗体、荧光偶联物、抗体缓冲液和封闭液；所述微流控芯片组包括微腔阵列芯片和外泌体捕获芯片。

2.根据权利要求1所述的一种单细胞外泌体静态检测试剂盒，其特征在于，所述特异性细胞保护荧光染剂由特异性膜蛋白荧光染剂与完全培养基混合制成，所述特异性膜蛋白荧光染剂使用PBS配置工作液，稀释倍数为1:500-1：2000；所述完全培养基按基本培养基、FBS和抗青霉素链霉素以一定体积比配置。

3.根据权利要求1所述的一种单细胞外泌体静态检测试剂盒，其特征在于，所述细胞缓冲液为磷酸盐缓冲液PBS。

4.根据权利要求1所述的一种单细胞外泌体静态检测试剂盒，其特征在于，所述外泌体检测抗体为带有生物素标记的检测抗体。

5.根据权利要求1所述的一种单细胞外泌体静态检测试剂盒，其特征在于，所述荧光偶联物的工作浓度稀释倍数为1:100-1:500，浓度大于100ug/ml。

6.根据权利要求1所述的一种单细胞外泌体静态检测试剂盒，其特征在于，所述抗体缓冲液是用磷酸盐缓冲液DPBS作为溶剂配制的质量分数为0.1-5％的BSA溶液，检测抗体浓度大于100ug/ml。

7.根据权利要求1所述的一种单细胞外泌体静态检测试剂盒，其特征在于，所述抗体封闭液是用磷酸盐缓冲液DPBS作为溶剂配制的质量分数为1-5％的BSA溶液。

8.根据权利要求1所述的一种单细胞外泌体静态检测试剂盒，其特征在于，所述微腔阵列芯片含有150行，130列，19500个微腔，每个微腔尺寸长、宽、深分别为400um、100um、30um。

9.根据权利要求1所述的一种单细胞外泌体静态检测试剂盒，其特征在于，所述外泌体捕获芯片含有多个外泌体膜蛋白捕获通道，每个捕获通道印刷有外泌体捕获抗体。

10.一种单细胞外泌体静态检测分析方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)细胞提取：对于贴壁细胞，使用胰蛋白酶消化细胞组织，加入FBS终止消化，震荡混匀，离心3-5min，使用细胞洗涤剂重悬，至管底出现淡白色细胞沉淀，弃上清，用一定量细胞洗涤剂重悬沉淀；对于悬浮细胞，离心3-5min，使用细胞洗涤剂重悬2次，后续处理一致；

(2)细胞特异性标记：离心弃上清，加入一定量特异性细胞保护荧光染剂，室温孵育10-20min；

(3)微腔阵列芯片预处理：使用细胞缓冲液浸润，干燥处理后，放入生物工作台；

(4)外泌体捕获芯片预处理：使用抗体封闭液浸泡10min，离心机甩干后，放入生物工作台；

(5)单细胞装载：将特异性标记的细胞均匀印刷在微腔阵列芯片的微腔中，将外泌体捕获芯片覆盖在微腔阵列芯片上方，并用夹具夹住，形成单细胞密闭微腔；

(6)细胞表型信息采集与处理：采集微腔中的单细胞特异性荧光以及细胞形态学特征导入细胞识别分析系统，进行单细胞的识别与表型分析；

(7)外泌体捕获：放入37℃，体积浓度为5％的CO₂的培养箱中，8-16h待细胞贴壁分泌外泌体；

(8)细胞外泌体信息的采集与处理：取下外泌体捕获芯片，使用抗体缓冲液清洗2次，取一定量混合的外泌体检测抗体铺在外泌体捕获芯片上，孵育20-30min，使用抗体缓冲液冲洗2次，取一定量荧光偶联物铺在外泌体捕获芯片上，避光孵育30-40min后，扫描、采集、处理外泌体捕获芯片上的外泌体荧光信息，并导入细胞识别分析系统；

(9)细胞静态分析与数据存储：细胞识别分析系统通过微腔中细胞的特异性荧光信号以及形态学特征识别细胞类别，统计存储在每个微腔中单细胞的荧光信号、所结合的特异性荧光抗体信息、分泌外泌体信息、细胞形态学信息、细胞类别以及细胞位置信息。