[发明专利]一种单细胞外泌体静态检测试剂盒及检测分析方法

说明书

本发明公开了一种单细胞外泌体静态检测试剂盒及检测分析方法，该试剂盒包括细胞表型分析用剂、外泌体检测用剂、微流控芯片组；所述细胞表型分析用剂包括特异性细胞保护荧光染剂和细胞缓冲液；所述外泌体检测用剂包括外泌体检测抗体、荧光偶联物、抗体缓冲液和封闭液；所述微流控芯片组包括微腔阵列芯片和外泌体捕获芯片。本发明所公开的试剂盒及方法可以对微量样品进行检测分析、对悬浮细胞以及贴壁细胞均能够进行静态表型分析和外泌体检测，检测通量高、检测结果准确可靠。

技术领域

本发明涉及单细胞分析领域，特别涉及一种单细胞外泌体静态检测试剂盒及检测分析方法。

背景技术

最早的流式细胞仪雏形诞生于1934年，Moldavan提出使悬浮的单个血红细胞流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置测量的设想。1953年Crosland-Taylor根据牛顿流体在圆形管中流动规律设计了流动室。其后又经过Coulter、ParkerHorst、Kamentsky、Gohde、Fulwyler、Herzenberg等人的不断改进，设计了光电检测设备和细胞分选装置、完成了计算机与流式细胞仪的物理连接及多参数数据的记录和分析、开创了细胞的免疫荧光染色及检测技术、推广流式细胞仪在临床上的应用。近20年来，随着流式细胞仪及其检测技术的日臻完善，人们越来越致力于样品制备、细胞标记、软件开发等方面的工作，以扩大FCM的应用领域和使用效果。

依托于流式细胞仪的FACS(Fluorescence activated Cell Sorting)系统在单细胞分析和分类方面提供了高吞吐量。在细胞类型，标准化底物和分选模式方面具有很高的灵活性，FACS是一种强大的工具。此外，当分析异质细胞样品时，其对稀有细胞分选(亚群1％)的适用性具有越来越高的诊断前景。一些FACS系统能够在几分钟的时间内以高纯度和高产量将单细胞沉积在微孔板上，从而能够进行进一步的下游分析，例如NGS(下一代测序)。FACS系统的普及和广泛使用使它们可以被广泛的用户使用。

然而，对于某些应用，FACS系统仍然受到一定程度的限制。细胞必须处于悬浮状态，这意味着组织需要解离，从而导致细胞功能和细胞-细胞相互作用以及组织结构的丧失。具有相似标记表达的亚群难以区分，并且荧光染料之间的发射光谱重叠可能会导致噪声水平升高，从而使低强度样品不可用于检测。此外，FACS分选对细胞活力可能具有不可忽略的影响。

FACS系统的最小样品量为几百微升至几毫升。这是由于以下事实：通常，较长的管路会导致高的体积，从而导致无法使用稀有样品，尤其是在需要分析整个样品时。最后，由于由非一次性组件组成的复杂系统，一般来说FACS系统难以实现无菌操作。

除此以外，多数流式细胞计是一种对于细胞分泌信号零分辨率的仪器，它只能测量一个细胞的诸如总核酸量，总蛋白量等指标，而不能鉴别和测出细胞随着培养的外泌体等指标。也就是说，它的时间分辨率为零，也无法实时在单细胞水平对细胞进行后续分析处理，并且价格昂贵，不适用于大众。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种单细胞外泌体静态检测试剂盒及检测分析方法，以达到可以对微量样品进行检测分析、对悬浮细胞以及贴壁细胞均能够进行静态表型分析和外泌体检测的目的。

为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

一种单细胞外泌体静态检测试剂盒，包括细胞表型分析用剂、外泌体检测用剂、微流控芯片组；所述细胞表型分析用剂包括特异性细胞保护荧光染剂和细胞缓冲液；所述外泌体检测用剂包括外泌体检测抗体、荧光偶联物、抗体缓冲液和封闭液；所述微流控芯片组包括微腔阵列芯片和外泌体捕获芯片。

上述方案中，所述特异性细胞保护荧光染剂由特异性膜蛋白荧光染剂与完全培养基混合制成，所述特异性膜蛋白荧光染剂使用PBS配置工作液，稀释倍数为1:500-1：2000；所述完全培养基按基本培养基、FBS和抗青霉素链霉素以一定体积比配置。

上述方案中，所述细胞缓冲液为磷酸盐缓冲液PBS。