[发明专利]一种三维TSPCs球体肌腱向分化诱导培养基及分化培养方法

说明书

本发明提供了一种三维TSPCs球体肌腱向分化诱导培养基，所述培养基为含有TGF‑β1、GDF5、维生素C、地塞米松、胰岛素的DMEM培养基。同时还提供了上述培养基的分化培养方法，是通过在体外构建三维球体培养的体系，并使用适宜的生物活性因子组合诱导后，在体外成功诱导TSPCs分化，并且体外模拟肌腱组织特征性的平行有序的结构，可以作为筛选并评价影响TSPCs分化功能因素的稳定的体外体系，用于探索并发现新的、潜在的、调节TSPCs分化功能的基因和生长活性因子。

技术领域

本发明属于细胞工程技术领域，特别涉及一种三维TSPCs球体肌腱向分化诱导培养基，还涉及一种三维TSPCs球体肌腱向分化培养方法。

背景技术

肌腱是连接骨骼和肌肉的纤维结缔组织，负责传递由骨骼和肌肉产生的力量而使身体发生运动。肌腱损伤常常发生于运动或者体力劳动中。随着人们生活方式的改变以及体育锻炼的增加，肌腱损伤日益增多，占运动损伤的50％。由于肌腱组织细胞少、血供差等，一旦损伤或者缺损，极难愈合，恢复肌腱结构和功能是医学领域目前最具挑战的难题之一。

近年来，随着干细胞生物学以及组织工程技术的发展给肌腱损伤治疗带来了希望。肌腱干/祖细胞(TSPCs)作为组织工程首选的种子细胞。2007年BI等第一次从人和鼠的肌腱组织中成功分离出TSPCs，并发现在体外培养这种细胞具有间充质干细胞的普遍特性，如克隆形成能力、自我更新能力以及多向分化潜能等。TSPCs在体外普通培养环境下，给予适宜的化学因子诱导后可以分化形成成熟的肌腱细胞；然而分化的肌腱细胞群体无法很好模拟肌腱组织本身的结构特征，缺乏典型的细胞间平行有序的排列结构，无法用来作为筛选和评价影响TSPCs分化功能因素的稳定体系，大大阻碍了探索并发现新的、潜在的、调节TSPCs分化功能的基因和生长活性因子。

发明内容

技术问题：为了解决上述难题，本发明提供了一种三维TSPCs球体肌腱向分化诱导培养基，所述培养基为含有TGF-β1、GDF5、维生素C、地塞米松、胰岛素的DMEM培养基。

优选地，其中，TGF-β1的浓度为5-20ng/ml，GDF5的浓度为5-20ng/ml，维生素C浓度为0.2-0.8μM，地塞米松的浓度为35-65μM，胰岛浓度为7-15μM。

优选地，其中，TGF-β1的浓度为15ng/ml，GDF5的浓度为10ng/ml，维生素C浓度为0.5μM，地塞米松的浓度为50μM、胰岛素的浓度为10μM。

同时，本发明还提供了一种TSPCs的三维球体体外培养方法，包括以下步骤：TSPCs于DMEM培养基中重悬，置于一定浓度CO₂的恒温孵箱中培养；待TSPCs至80-90％融合后，接种于低粘附培养皿中，加入1-3％低浓度的胎牛血清、10-30ng/ml bFGF以及30-40ng/mlEGF生长因子，置于一定浓度CO₂的恒温孵箱中培养，即得TSPCs的三维球体。

优选地，其中选用加入2％低浓度的胎牛血清、20ng/ml bFGF以及36ng/ml EGF生长因子。

同时，本发明还提供了一种三维TSPCs球体肌腱向分化培养方法，包括以下步骤：将TSPCs的三维球体置于离心管中，通过差异性梯度离心的方法去除散在的单个细胞和废弃的培养基；轻柔加入诱导培养基，转移至铺有Matrigel的正常粘附培养皿中培养，每2-3天更换新鲜的诱导培养基。

优选地，所述培养基为含有TGF-β1、GDF5、维生素C、地塞米松、胰岛素的DMEM培养基。

优选地，其中，TGF-β1的浓度为5-20ng/ml，GDF5的浓度为5-20ng/ml，维生素C浓度为0.2-0.8μM，地塞米松的浓度为35-65μM，胰岛浓度为7-15μM。