[发明专利]一种用于copA和czcD基因双重荧光定量PCR检测的引物和探针组及试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于copA和czcD基因双重荧光定量PCR检测的引物和探针组及试剂盒；引物组包括用于检测copA基因的上游引物，如SEQ ID NO.1所示；下游引物，如SEQ ID NO.2所示；探针，如SEQ ID NO.3所示。用于检测czcD基因的上游引物，如SEQ ID NO.4所示；下游引物，如SEQ ID NO.5所示；探针，如SEQ ID NO.6所示；探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；试剂盒包括：PCR反应液、混合酶液、阳性标准品、弱阳性质控品和强阳性质控品；该试剂盒通过特异性的引物和探针、在PCR反应阴性对照、弱阳性质控品、强阳性质控品的监控下，与阳性标准品进行同步测定，测得的结果具有灵敏度高、准确度高的特点。

技术领域

本发明涉及一种用于copA和czcD基因双重荧光定量PCR检测的引物和探针组及试剂盒，属于生物检测技术领域。

背景技术

当前，环境重金属污染越来越受到人们的关注。相对于有机污染而言，土壤重金属污染持续时间长，无法通过土壤自然过程降解，对环境的危害更持久，从而影响土壤微生物的构成。

铜和镉是我国土壤重金属污染中比较典型的两种重金属元素，有时会产生联合污染。重金属污染会对土壤细菌产生选择压力，进而影响土壤细菌的构成和数量。copA是编码多重抗铜氧化酶的基因，广泛存在于耐铜细菌中，可作为耐铜细菌的遗传标记物。czcD是编码阳离子外排蛋白，从而缓解土壤重金属镉对细菌的毒性。因而，可以通过测定重金属耐受基因的数量，来分析重金属对土壤细菌的影响。

土壤本身也是重金属耐受基因的一个重要库，但是，传统的定量检测方法，主要是基于微生物培养测序，缺乏相对有力的手段来确定耐受基因的数量。随着实时荧光PCR检测技术的发展，特别是探针法的进步，能及时确定土壤中耐受基因的数量，对于控制环境重金属污染，分析细菌重金属耐受性具有积极意义。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种用于copA和czcD基因双重荧光定量PCR检测的引物和探针组，该引物和探针组可配合对copA和czcD基因特异性的核酸片段体现出良好的扩增效率。

本发明的第二个目的在于提供一种试剂盒，该试剂盒通过特异性的引物和探针、在PCR 阴性对照、弱阳性质控品、强阳性质控品的监控下，与阳性标准品同步检测，测得的结果具有灵敏度高、准确度高的特点。

实现本发明的第一个目的通过采取如下技术方案达到：

一种用于copA和czcD基因双重荧光定量PCR检测的引物和探针组，包括，

上游引物copA-F：5’ATYGAGCTKCATYTGACCGG 3’，如SEQ ID NO.1所示；

下游引物copA-R：5’ATYTTCMAGKTCRCTCCACATGCC 3’，如SEQ ID NO.2所示；

探针copA-P：5’TGSATBGGRTGSGYCATCATVSTGTC 3’，如SEQ ID NO.3所示；探针的5’端标记有FAM荧光基团，3’端标记BHQ1基团。

上游引物czcD-F：5’CGACGCCGCGCACATG 3’，如SEQ ID NO.4所示；

下游引物czcD-R：5’TANCCSSCGACGCCGA 3’，如SEQ ID NO.5所示；

探针czcD-P：5’CCGCGCCGARRTSCTCG 3’，如SEQ ID NO.6所示；探针的5’端标记有VIC荧光基团，3’端标记有BHQ1基团。

进一步地，引物和探针根据copA基因片段保守区进行设计，该靶片段的序列如SEQID NO.7所示；引物和探针根据czcD基因片段保守区进行设计，该靶片段的序列如SEQ ID NO.8所示。