[发明专利]一种短DNA序列在柑桔类群和柑桔种苗鉴定的应用

权利要求书

1.一种引物在柑桔杂合状态或柑桔类群鉴定中的应用，其特征在于，所述引物的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，所述引物序列纯度要求为丙烯酰胺凝胶电泳纯化级别。

2.一种目标短序列在柑桔杂合状态或柑桔类群鉴定中的应用，其特征在于，所述目标短序列由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物扩增柑桔基因组得到。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述目标短序列的获得方法包括：

(1)提取待分析柑桔类材料的基因组DNA，DNA聚合酶链式反应PCR扩增获得目标短序列；

(2)将扩增产物加入琼脂糖凝胶孔中进行电泳检测，回收目的DNA片段；

(3)将回收的目的DNA片段加尾，采用克隆载体pGEM-T-easy获得重组T载体；将连接好的重组T载体转化大肠杆菌感受态细胞E.coliDH5α；蓝白斑筛选，挑取白色单菌落5-6个，LA液体培养基37℃恒温摇床振荡过夜培养，菌液送测序公司测序。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述PCR体系如下：1×PCR Buffer，1.5mmol·L-1的Mg 2+，0.2mmol·L-1的dNTPs，0.33nmol·L-1的上、下游引物，1U的高保真TaqDNA聚合酶，DNA模板100ng，总体积50μL。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述PCR的扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性45s，62℃退火40s，72℃延伸45s，每次循环降低0.5℃，10个循环；94℃变性45s，58℃退火40s，72℃延伸40s，22个循环；72℃延伸5min；最后PCR产物4℃保存。

6.一种柑桔杂合状态鉴定方法，其特征在于，所述方法包括使用SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2所示的引物扩增柑桔基因组，回收目的扩增产物后挑取5-6个单克隆送测序，测序得到两种序列则柑桔为杂合状态，得到一种序列则柑桔为纯合状态。

7.一种柑桔类群鉴定方法，其特征在于，所述方法包括使用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物扩增柑桔基因组，回收目的扩增产物后挑取5-6个单克隆送测序，将测序结果与主要柑桔类群的代表序列及其SNP、SSR和Indel组合特征表进行比对分析，所述主要柑桔类群的代表序列及其SNP、SSR和Indel组合特征表如下：

从而鉴定柑桔类群。