[发明专利]一种短DNA序列在柑桔类群和柑桔种苗鉴定的应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种短DNA序列在柑桔类群和柑桔种苗鉴定的应用，鉴定短DNA序列的引物序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，以及由该引物界定的序列在主要柑桔类群的代表序列及其SNP、SSR和Indel组合特征表。本发明通过给定引物扩增柑桔基因组，得到目标短序列并进行克隆测序分析；根据片段SSR、Indel和/或SNP变异特性或变化组合，可对柑桔的杂合状态、柑桔类群和柑桔种苗进行鉴定。本发明通过对一段特定短序列的克隆测序，比较测序序列的特征，完成柑桔类果树不同材料的分析鉴定。通过对序列进行基因组扩增、克隆、测序和与组合特征表比对分析，对柑桔类果树进行类群区分。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种短DNA序列在柑桔类群和柑桔种苗鉴定的应用。

背景技术

柑桔类果树属于芸香科，由于无融合生殖、属种间易于杂交、无性变异容易发生以及栽培广泛、历史悠久等的影响，柑桔类果树产生了丰富的变异，既有广泛栽培的柑橙桔柚，也有特色种植的香橼柠檬来檬以及香橙酸橙，还有野生半野生的宜昌橙大翼橙等，以及主要用作砧木的枳及其杂种，主要分布在澳大利亚的澳指檬和澳沙檬等。柑桔分类及系统演化研究对厘清柑桔类果树的遗传和进化关系，更好的认识和开发利用柑桔类果树，开展柑桔遗传育种以及种质资源的进一步收集、保护及评价利用等都有指导作用。目前国际上比较公的柑桔分类系统是W.T.Swingle的大种分类法和田中长三郎的小种分类法。W.T.Swingle将柑桔类植物划分为真正柑桔组，包括6属，其中的柑桔属栽培价值最高，划分为16种，8变种。田中长三郎则将柑桔类植物划分为4个属，承认145个种。柑桔及近缘属的分类差异如此大，而且争议比较大，其主要原因是传统柑桔分类主要依据形态指标。形态指标不仅受到环境变化的极大影响，在不同时间地点容易出现同物异形和异物同形的现象，而且形态指标的数量和类型也比较有限，全面、真实、准确的测试和分析难以大量展开，使得真实全面地反映遗传上的差异比较困难。

一个生物性状归根结底是由遗传决定的，遗传的本源则是其完整的基因组序列。解读出完整的序列并进行比较研究，是准确鉴定个体差异，研究系统进化、发掘基因功能的更有效而可靠的手段。但完整的柑桔类基因组序列比较大，高度杂合，对各兴趣个体完整解读基因组并进行比较研究，费用高，难度大，需要专门的设备和知识技能；同时，亲缘关系相近的物种，基因组的大部分序列非常相似甚或一致，其分析对个体鉴定没有贡献或贡献有限，2017年对黑猩猩的基因组测序和人类基因组的比较发现，黑猩猩和人类基因组的DNA序列相似性达到99％，即使考虑到DNA序列插入或删除，两者的相似性也有96％。发现对类群或个体差异有贡献的基因组序列位点，再对这些位点进行深入分析，将减少大量相似序列的干扰，极大地降低研究难度，减少分析和测试的费用和时间，方便对更多个体和材料的分析研究。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：形态指标数量和类型有限，获取的时间周期长，而且难以准确区分不同样品；柑桔类基因组序列比较大，高度杂合，对各兴趣个体完整解读基因组并进行比较研究，费用高，难度大。

解决以上问题及缺陷的难度为：形态指标的准确获取需要将评价材料布置在相同的地域和管理条件下，经过受过专业培训的技术人员至少3年以上的连续观察，需要耗费大量的人力物力进行管理，而且形态指标数量和类型有限，难以准确区分不同样品。基因组测序是比较准确的方法，但目前即使采用价格最便宜二代测序方法，要组装获得完整的兴趣个体的基因组序列并进行比较分析，其费用也至少在百万人民币以上，而且由于获得的数据非常庞大，达到几十个GB，一般计算机和普通人很难进行后续分析。