[发明专利]用于检测裸盖鱼的RPA引物、探针及检测方法

说明书

本发明提供一种检测裸盖鱼的RPA引物、探针和检测方法，是基于裸盖鱼的NADH₂基因设计的，RPA探针的长度为46‑54bp，且在探针中间距5’端32bp的位置处采用dSpacer修饰，dSpacer分子两侧的距5’端31bp和34bp位置的胸腺嘧啶（dT）分别被荧光基团FAM和淬灭基团BHQ1取代，并且在探针的3’末端也需要通过阻塞基团C3Spacer修饰，RPA技术具有操作简便、反应快速、灵敏度高、特异性强、无需精密仪器等优点，本发明基于RPA技术设计裸盖鱼特异性引物探针，建立的检测方法操作方便，可实现现场检测。本发明的检测方法在15‑20分钟内完成检测，可快速样品是否为裸盖鱼。

技术领域

本发明涉及检测领域，尤其涉及一种检测裸盖鱼的RPA引物、探针和检测方法。

背景技术

裸盖鱼（Anoplopoma fimbria），也俗称黑鳕，属于辐鳍鱼纲、鲉形目、黑鲉科。该鱼捕捞量每年全美只有一万吨，价格昂贵，约200-300元一斤。其拥有丰富的ω-3脂肪酸，且容易进行人工养殖，因此是重要的经济鱼类。有研究表明ω-3脂肪酸对人体大有裨益，对于平常人，不仅能够改善心血管健康，预防致命性心律失常、缓解炎症，对于胎儿的大脑发育和视网膜正常发育也至关重要，还在一定程度上影响了儿童认知、语言或运动能力。

裸盖鱼属于深海大型鱼类，售卖时一般去除头尾，以鱼块、鱼扒等方式分割小包装售卖，因此无法通过形态学上区分掺伪鱼类。在中国香港食物安全中心发布的《有关识别及标签油鱼/鳕鱼的指引》中允许使用“银鳕鱼”对裸盖鱼进行标注。据市场调查数据显示，我国市场上销售的裸盖鱼，有85.7 %被鉴定为南极犬牙鱼。南极犬牙鱼，属辐鳍鱼纲、鲈形目、南极鱼科、犬牙南极鱼属，含小鳞南极犬牙鱼（Dissostichus eleginoides）和鳞头南极犬牙鱼（Dissostichus mawsoni）两个经济种）。南极犬牙鱼主要存在过度捕捞问题，如今出于对该鱼的保护，只有少数国家和地区可以有限的捕捞，但非法捕捞仍然存在，鉴于我国的鱼类溯源系统并没有其他欧美国家健全，据报道非法捕捞的南极犬牙鱼将在中国进行销售，因此导致了我国大部分销售的裸盖鱼实为南极犬牙鱼的现状。在中国香港发布的指引中允许使用“白鳕鱼”对南极犬牙鱼进行标注。

发明内容

我国市场监督管理总局于2019年发布了食品补充检验方法《鳕鱼及其制品中裸盖鱼、油鱼和南极犬牙鱼源性成分检测》（BJS 201907），使用方法为实时荧光PCR检测方法。另外还有国家标准方法GB/T 35918-2018《动物制品中动物源性检测基因条码技术 Sanger测序法》中规定了鱼类基于基因条形码测序的通用鉴别方法，可对裸盖鱼进行检测。但是，这些方法需要依赖昂贵的精密设备如测序仪、荧光PCR仪等，对人员操作、环境条件等要求高，对设备的校正维护等也有较高的成本，因此不符合在移动实验室、现场快速检测、厂家进货验收、企业自检等情景的操作需求。另外， Sanger测序法因受检测原理限制（需要每个碱基单峰，以识别碱基ATGC），不能对多来源样品检测，因此无法应用于对掺伪、混合样品检测中。

为此，本发明提供一种用于检测裸盖鱼的RPA引物、探针和检测方法。

重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）技术做为一种新型的核酸扩增技术，其被誉为最有可能取代PCR的技术。该技术具有操作简便、反应快速、灵敏度高、特异性强、无需精密仪器等优点，使其在临床诊断和疾病防控等现场快速检测方面显示出了巨大的潜力。相比其他技术，RPA技术有更多的灵活性，不仅可以检测DNA也可以检测RNA，且通过不同的修饰可实现以不同的方式展示实验结果。如与便携式扩增仪结合可实时在线监测实验结果，与凝胶电泳结合可实现产物的回收，与试纸条的结合可以实现无需仪器设备快速的读取实验结果。