[发明专利]叶斑艺兰花F3′5′H基因的植物表达载体构建及其应用

权利要求书

1.一种重组载体，其特征在于，含有叶斑艺兰花类黄酮3',5'-羟化酶基因即F3'5'H基因，所述F3'5'H基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.如权利要求1所述的重组载体，其特征在于，用于构建所述植物表达载体的起始载体为pCAMBIA1301。

3.如权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pCAMBIA1301-35S-F3'5'H，在起始载体pCAMBIA1301上连有启动子35S，其后紧接F3'5'H基因。

4.如权利要求1-3所述的任意一种重组载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)叶斑艺兰花F3'5'H基因的扩增

对转录组中获得的F3'5'H基因序列进行比对，发现F3'5'H基因序列具有5’，利用RACE技术对3’进行扩增,得到全长基因片段；

(2)F3'5'H基因的TA克隆

回收F3'5'H的编码区基因片段，并将其连接到pMD18-T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA,通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD-F3'5'H，筛选正向阳性克隆进行菌液富集后提取质粒；

(3)F3'5'H基因植物表达载体pCAMBIA1301-35S-F3'5'H的构建

用NcoI和BstEII对重组质粒pMD-F3'5'H进行双酶切，将酶切后包含F3'5'H全长的条带进行回收；然后用NcoI和BstEII酶切pCAMBIA1301载体，将所得到的载体片段进行回收，所得到的全长序列和载体序列上带上了互补的粘性末端，再将二者连接后，转化大肠杆菌，通过酶切鉴定筛选出重组子，构建起了植物表达的重组载体pCAMBIA1301-35S-F3'5'H。

5.如权利要求4所述的一种重组载体的构建方法，其特征在于，所述步骤：

(1)叶斑艺兰花F3'5'H基因的扩增具体包含以下步骤：

①PCR引物

根据转录组中获得的F3'5'H基因片段设计得到以下引物，

B26：5’-GACTCTAGACGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT-3’；

F3'5'H1：5’-CTCTCAGCATACCTCACTACGCCTC-3’；

F3'5'H2：5’-GTTCCCAAGAAATACTGCACCATCA-3’；

②用上述反转录产物进行PCR，体系如下：10xPCR buffer2.5ul、dNTP mixture(10mM)2.5ul、F3’5’H10.5ul、B260.5ul、cDNA1.5ul、Taq plus0.25ul和H₂O16.25ul，总容量为25ul；

③PCR反应程序如下：96℃预变性5min；94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min，4℃终止反应；

④同样的体系和反应程序，步骤②③中得到的RCR产物为模板做第二轮PCR，引物为F3'5'H2和B26；

⑤将所得片段连入pMDl8-T，酶切鉴定后进行序列测定；

⑥根据已测定序列及其重叠区域，拼接出目的基因的全长cDNA，分别设计引物：

F3'5'H3：5’-CGTTCGGAGCGGGGCGGAGGATTTGC-3’和F3'5'H4：5’-CGGGAAGTTAATGGGGATGCTGATGG-3’，PCR扩增全长序列做进一步的验证。

6.如权利要求5所述的构建方法构建得到的重组载体在制备农杆菌转基因植株中的应用。

7.权利要求6所述的重组载体的应用，其特征在于，重组载体在制备农杆菌转基因铁皮石斛中的应用。