[发明专利]叶斑艺兰花F3′5′H基因的植物表达载体构建及其应用

说明书

本发明公开了一种含有叶斑艺兰花类黄酮3',5'‑羟化酶基因(F3'5'H)且能提高植物花青素含量的专用植物表达载体pCAMBIA1301‑35S‑F3'5'H。本发明是利用RACE的方法从叶斑艺兰花中克隆出F3'5'H基因，用35S启动子在铁皮石斛中过量表达，并通过类似叶盘(原球茎)转化法将其转入野生型铁皮石斛中。实验结果表明在转基因铁皮石斛中F3'5'H基因能够正常表达，转入F3'5'H基因的生长情况比对照植株，转基因植株表现为更健壮，茎秆和叶片显示紫红色的特点，过量表达F3'5'H基因能够很大程度的提高增加转基因铁皮石斛中F3'5'H酶活性，蛋白质含量、可溶性糖含量增加，花青素和类黄酮物质含量增加。表明了叶斑艺兰F3'5'H基因对铁皮石斛生长发育有促进作用，且促进了类黄酮和花青素的合成，导致植株出现紫红色显色。

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体地，涉及一种类黄酮3′,5′-羟化酶基因F3′5′H的植物表达载体pCAMBIA1301-35S-F3′5′H，其构建方法及在转基因植物中的应用。

背景技术

叶(线)艺兰(线艺兰)是指兰科(Orchidaceae)兰属(Cymbidium)植株的叶片上镶嵌着或金黄色、或银白色、或浓绿色、或朱红色、或墨黑的嘴、边、点、线、斑的中国兰统称，大致可分为线艺兰、斑艺兰、水晶艺兰这三大类，随着人们对兰花叶艺欣赏和了解的深入也出现了叶蝶等不同颜色和形状变异类型。叶艺兰品种以墨兰(C.sinense)最多(如‘叶艺白墨’、‘银拖墨兰’、‘达摩’、‘闪电’、‘日向’、‘瑞玉’、‘大石门’)，建兰(Cymbidiumellsifolium)次之，春兰(C.goeringii)、蕙兰(C.faberi)与寒兰(C.kanran)较少，其栽培历史已有千年之久，被誉为“花中君子”，是珍贵的观赏花卉。叶(线)艺最早流行于日本，随着叶(线)艺兰‘加冶屋’的问世，日本兰界掀起了一场追求叶艺兰花品种的热潮，形成极为火爆的叶(线)艺兰市场氛围，如40年代墨兰叶(线)艺品种‘瑞玉’售价曾达5万日元(3苗)，到60年代的‘鹤之华’售价达650万日元(7苗)，而‘达摩’每苗更是高达20-30万美元。最近几十年，叶(线)艺在我国大陆流行，虽然起步较迟，但发展迅速，奇花、奇叶和矮种等各种变异类型层出不穷。兰花在无花时，较难交易，容易产生纠纷，而叶艺兰以观叶为主，可通过叶形、叶态、颜色等来鉴别，其商品价值根据线艺类型不同可成倍甚至数百倍地增加，市场前景十分广阔。

目前，参与花色形成的类黄酮物质生物合成途径已较为明确。在类黄酮合成途径中4-香豆酰辅酶A(coumaroyl-coenzyme A)是3类花青素苷的合成的前体，它能够在查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)的催化下合成4,2’,4’,6’-四羟基苯基苯乙烯酮(tetrahydroxychalcone)。4,2’,4’,6’-四羟基苯基苯乙烯酮在查尔酮异构酶(chalconeisomerase,CHI)催化下合成无色的柚皮素(naringenin)。柚皮素能够被黄烷酮-3-羟基化酶(flavanone 3-hydroxylase,F3H)催化成二氢堪非醇(dihydrokaempferol,DHK)，DHK被类黄酮-3′-羟基化酶(flavonoid 3′-hydroxylase，F3′H)催化后生成二氢栎皮黄酮(dihydroquercetin,DHQ)。类黄酮-3′,5′-羟基化酶(flavonoid3’,5’-hydroxylase,F3′5′H)催化DHK生成二氢杨梅黄酮(dihydromyricetin,DHM)(步骤a)。二氢栎皮黄酮在二羟黄酮还原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)，花青素苷合成酶(anthocyanidinsynthase,ANS)或3-葡萄糖基转移酶(flavonoid 3-glucosyl transferase,3GT)酶的作用下生成红色至红紫色的矢车菊素(cyaniding 3-O-glucoside,Cy)。二氢杨梅黄酮可以在以上三种酶的催化作用下生成蓝紫色的飞燕草素(delphinidin 3-O-glucoside,Dp)[24]。F3′5′H基因在花青素苷的合成中起着重要的调控作用，故对叶斑艺兰F3′5′H基因进行研究，可使花青素苷的种类或含量变化，进而定向改良叶色。