[发明专利]一种生物制备甘露寡糖的方法

权利要求书

1.一种生物制备甘露寡糖的方法，其特征在于，在出发菌株中过表达甘露糖激酶、甘露糖二糖磷酸化酶、甘露糖6-磷酸变位酶，构建获得工程菌，所述工程菌用于生产甘露三糖，所述出发菌株为谷氨酸棒杆菌；

用于发酵生产甘露寡糖的谷氨酸棒杆菌重组菌株的构建方法，包括以下步骤：

1）在谷氨酸棒杆菌中引入来源于长双歧杆菌的甘露糖激酶MK ，其氨基酸序列为SEQID NO:1，和来源于高温厌氧杆菌属的甘露二糖磷酸化酶MBP，其氨基酸序列为 SEQ ID NO:2，得到谷氨酸棒杆菌重组菌株，命名为菌株MOS1；

2）向重组谷氨酸棒杆菌MOS1中引入来源于大肠埃希氏菌的甘露糖6-磷酸变位酶ManB，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3，得到重组谷氨酸棒杆菌，命名为MOS2；

所述步骤1）中重组谷氨酸棒杆菌MOS1的具体方法包括以下步骤：

合成来源于长双歧杆菌的甘露糖激酶MK基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:4，和来源于高温厌氧杆菌属的甘露二糖磷酸化酶MBP基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:5，并要求其提供含有甘露糖激酶基因的载体pUC57-MK和含有甘露二糖磷酸化酶基因的载体pUC57-MBP；以质粒pUC57-MK为模板PCR扩增甘露糖激酶基因，以质粒pUC57-MBP为模板PCR扩增甘露二糖磷酸化酶MBP基因，连接至载体pEC-XK99E中，得到携带有MK基因和MBP基因的重组载体，命名为pE-MK-MBP；通过电转化方式向谷氨酸棒杆菌中导入重组质粒pE-MK-MBP，得到谷氨酸棒杆菌重组菌株MOS1；

所述步骤2）中重组谷氨酸棒杆菌MOS2的具体方法包括以下步骤：PCR扩增来源于大肠埃希氏菌的甘露糖6-磷酸变位酶ManB基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:6，连接入载体pE-MK-MBP中，得到携带甘露糖激酶MK基因、甘露二糖磷酸化酶MBP基因和甘露糖6-磷酸变位酶ManB基因的重组载体，命名为pE-MK-MBP-ManB，通过电转化方式向谷氨酸棒杆菌中导入重组质粒pE-MK-MBP-ManB，得到谷氨酸棒杆菌重组菌株MOS2；

谷氨酸棒杆菌重组菌株MOS2制备单一产物甘露三糖的具体方法包括以下步骤：

a.谷氨酸棒杆菌重组菌株的培养：选用丰富培养基，在30℃、200rmp条件下对谷氨酸棒杆菌重组菌株MOS2进行培养，得到的谷氨酸棒杆菌重组菌株菌液，离心收集菌体；

b.以甘露糖为底物生产甘露三糖：取谷氨酸棒杆菌重组菌株MOS2的浓缩菌液，加入终浓度为40 g/L的甘露糖进行发酵，发酵条件为：温度30℃，pH 7.0，菌体浓度OD₆₀₀为60；

发酵结束后，对样品进行高效液相色谱检测，经过48小时反应，重组菌株MOS2发酵甘露糖获得单一产物甘露三糖，产量为5.0 g/L。