[发明专利]一种生物制备甘露寡糖的方法

说明书

本发明公开了一种生物制备甘露寡糖的方法，涉及构建体外多酶催化反应体系，实现转化甘露糖合成甘露寡糖；本发明还公开了重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，并将重组菌株应用于甘露寡糖的发酵合成，实现了以甘露糖为原料发酵法合成甘露二糖和甘露三糖产物，并且实现发酵生产单一产物甘露三糖，便于产物分离纯化，所获得的甘露寡糖可应用于食品、医药、化妆品等领域。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种生物制备甘露寡糖的方法，属于生物制造领域。

背景技术

甘露寡糖(MOS)及其衍生物是自然界中存在的一系列功能化合物，例如甘露寡糖由2至10个甘露糖组成的低度聚合糖，因为这些寡糖具有多种多样的结构，因而衍生出不同的生物学功能，并在食品、制药和动物饲料等行业中发挥着重要作用。首先，MOS同样可以选择性促进人类肠道有益菌群增长，可以作为非营养性食品添加剂。此外，甘露二糖能够明显改善和提高鸡的免疫能力，增强对沙门氏菌的杀伤力，因而可用作饲料以控制沙门氏菌在家禽中的传染。

魔芋、角豆胶、瓜儿豆胶等来源的甘露聚糖经甘露聚糖酶水解可用于制备甘露寡糖，该方法是目前的甘露寡糖主要制备途径。然而，单纯依赖酶法水解或提取甘露寡糖及其衍生物，一方面，无法获得聚合度均一的产品，往往需要复杂的分离纯化工艺；另一方面，生产方法依赖于天然多糖资源，限制了寡糖产物多样性。因此，亟待开发新的甘露寡糖的绿色制备技术，获得产品单一、构型多样及结构可控的甘露寡糖产品，建立低成本、高效率的生物合成技术，为甘露寡糖更广范围内应用提供基础。

发明内容

本发明目的一是提供一种制备甘露寡糖的方法，其以甘露糖为底物，通过体外多酶催化反应催化生产甘露寡糖，该方法具有产率高、环境友好、产物构型单一等优点。

其特征在于，以甘露糖为底物，加入甘露糖激酶和甘露糖磷酸化酶，进行多酶催化反应。在本发明中，甘露糖为底物，甘露糖经甘露糖激酶催化转化为甘露糖-1-磷酸，甘露糖-1-磷酸和甘露糖经甘露糖磷酸化酶催化生成甘露二糖和甘露三糖。

优选地，甘露糖原料可以是甘露糖纯品也可以是采用酸解或者酶转化方法转化魔芋、淀粉、纤维素、蔗糖、麦芽糖、果糖、葡萄糖、甘露醇等原料获得的甘露糖。

优选地，多酶催化反应中甘露糖的浓度为1-200g/L，进一步优选为5-50g/L，更优选为8-20g/L，最优选为20g/L。

优选地，多酶催化反应的反应温度为10-95℃，进一步优选为20-80℃，更优选为30-60℃，最优选为37℃。

优选地，多酶催化反应的反应时间为0.5-150小时，进一步优选为1-60小时，更优选为6-48小时，最优选为30小时。

优选地，多酶催化反应中还加入缓冲液、磷酸盐、金属离子。

优选地，甘露糖激酶来源于长双歧杆菌(SEQ ID NO:1)，或其氨基酸序列与上述来源的甘露糖激酶具有至少60％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％的同一性；甘露二糖磷酸化酶来源于高温厌氧杆菌属(SEQ ID NO:2)，或其氨基酸序列与上述来源的甘露二糖磷酸化酶具有至少60％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％的同一性。

本发明目的二是提供发酵生产甘露寡糖的微生物重组菌株的构建方法。

所述重组菌株的构建方法包括以下步骤：

1)向微生物重组菌株中引入由甘露糖激酶和甘露糖磷酸化酶组成的甘露寡糖合成途径。

2)增强微生物体内的甘露糖6-磷酸变位酶，促使胞内甘露糖6-磷酸转化为前体甘露糖1-磷酸。

所述微生物重组菌株的构建方法适用于多种微生物模式菌株，包括，大肠杆菌，谷氨酸棒杆菌，枯草芽孢杆菌，乳酸菌，酿酒酵母等微生物。