[发明专利]一种基于甲基化检测的肿瘤诊断试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种基于甲基化检测的肿瘤诊断试剂盒及其应用。本发明建立了一种基于低深度全基因组测序的肿瘤预测指标，即低深度全基因组甲基化特征，依据低深度全基因组甲基化特征，可以在肿瘤/非肿瘤样本中，通过随机森林算法建立预测模型，实现肿瘤样本的早期筛查。本发明的肿瘤预测指标具有很好的实用性和广泛的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物医学领域一种基于甲基化检测的肿瘤诊断试剂盒及其应用。

背景技术

循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)，含有肿瘤特异性的基因组变异和表观修饰特征，可以应用于癌症早期筛查、诊断和分期、指导靶向用药、疗效评估、复发监测等各方面。目前肿瘤液体活检通常利用PCR和靶向测序技术，检测某一组特定的基因水平变异或表观基因组变异，如ctDNA点突变、基因融合、特异基因的甲基化等。1)PCR技术成本低、操作简便，通常用于检测一个或几个已知变异，无法检测基因融合等复杂突变，无法检测未知突变，覆盖范围较小；2)靶向测序技术适合多重靶标检测，包括复杂突变，但试剂盒一般价格昂贵、操作复杂、耗时较长。在应用过程中，需要根据靶标的数量和特性，选取适合的检测方法。基于NGS平台的ctDNA基因组变异检测，由于受到ctDNA在cfDNA(cell free DNA,即在血液中游离的自身DNA)中占比较低的限制，实质上都是低频变异的检测，对于检测方法的灵敏度、检测下限有较高要求，需要保证较高的测序深度，检测费用较高，难以大规模推广；此外，检测范围局限在预先设定的靶标基因区域内，受目标区域选取的影响较大，不同的检测组合预测结果波动性较大。

而使用基于低深度全基因组测序的指标，能够克服上述问题。现有指标包括：ctDNA结构(片段大小、断点分布)、拷贝数变异等，也可作为肿瘤的标志性特征。这些标志物可在低深度测序下获得，检测成本低，易于大规模人群早筛。其中，1)ctDNA的片段大小、断点分布等结构性特征，往往与核小体占位、转录因子结合、开放染色质区域等基因功能区相关。Stephen Cristiano等在1-2×的测序深度下，通过计算肿瘤特征区域内100-150bp短cfDNA片段数/151-220bp长cfDNA片段数的比值，对肿瘤/健康诊断的ROC曲线下面积AUC＝0.94，其中对7种不同癌种的预测灵敏度70％，特异性95％(Cristiano et al.,2019)。KunSun等在3.2×的测序深度下，计算组织特异开放染色质区域的cfDNA断点丰度，发现HCC样本的断点丰度指标显著高于健康样本，表明这一指标具有区分肿瘤/健康样本的能力(Sunet al.,2019)；2)血液中ctDNA拷贝数的变化(Copy number variations,CNV)是除癌症基因突变或基因融合以外引起癌变的一种主要DNA结构性变异，很多肿瘤都具有特定的CNV。例如肝癌样本中，拷贝数异常倾向于发生在chr1和chr8两条染色体上(Jiang et al.,2015)；根据全基因组拷贝数结果计算绝对离差中位数t-MAD，对肿瘤/健康样本诊断的AUC＝0.69(Florent Mouliere et al.,2018)。

现有的基于低深度全基因组测序的液体活检标志物，仅限于上述依赖于基因组序列信息的指标，尚未将低测序深度下的甲基化特征纳入考虑；从实验方法上，也尚未建立同时记录ctDNA中的基因组序列和甲基化修饰这两种重要的肿瘤特异标志物的文库构建方法，现有的基因变异检测和甲基化检测需要遵循不同的技术路线，取两份样本单独构建文库。

发明内容

本发明的目的首先在于提供一种基于甲基化检测的肿瘤诊断试剂盒。

所述基于甲基化检测的肿瘤诊断试剂盒，包括特征检测试剂，所述特征检测试剂包括DNA甲基化特征检测试剂，所述DNA甲基化特征包括：区域内甲基化的DNA分子数比值和/或区域内甲基化的DNA分子长度比值；

所述区域内甲基化的DNA分子数比值包括：区域内甲基化的DNA分子数与全基因组DNA总分子数的比值，和/或，区域内甲基化的DNA分子数与区域内甲基化的DNA分子数和非甲基化的DNA分子数总和的比值；