[发明专利]乙型肝炎病毒（HBV）特异性T细胞检测方法及其应用

权利要求书

1.一种体外获得HBV特异性T细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

分离样品中的外周血单个核细胞；

培养扩增所述的外周血单个核细胞；

取鼠抗人IFN-γ捕获抗体进行包被，洗涤，加入封闭液封闭；

去除封闭液，加入刺激溶液和所述扩增的外周血单个核细胞，孵育，洗涤，去除液体；

加入生物素化小鼠抗人IFN-γ单克隆抗体，孵育，去除生物素化小鼠抗人IFN-γ单克隆抗体，洗涤，去除液体；

加入山羊碱性磷酸酶抗生物素抗体，孵育，去除山羊碱性磷酸酶抗生物素抗体，洗涤，去除液体；

加入碱性磷酸酶进行显色反应，加水终止显色反应，烘干，通过所述显色反应后的斑点形成细胞数量判断所述T细胞肽库筛选结果，若显色反应后的斑点形成细胞数量为阴性对照中的斑点形成细胞数量的两倍或以上，则T细胞肽库筛选结果为阳性；

阳性的T细胞即为HBV特异性T细胞；

其中，所述刺激溶液为肽库溶液；

所述肽库溶液为混合有构成S蛋白的重叠肽的溶液、混合有构成C蛋白的重叠肽的溶液、混合有构成P蛋白的重叠肽的溶液、混合有构成X蛋白的重叠肽的溶液的组合，所述肽库溶液的浓度为1-8μg/mL；

所述封闭液为含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基

所述培养扩增所述的外周血单个核细胞包括以下步骤：

取外周血单个核细胞，加入培养基A和肽库溶液，孵育；

加入培养基B，孵育；

加入培养基C，孵育；

离心，收集沉淀的细胞，洗涤，静息，即得扩增的外周血单个核细胞；

其中，加入培养基C孵育时，若所述外周血单个核细胞所占的面积为细胞所在平面面积的2/3或以上时，补加培养基C；

其中，所述培养扩增不使用IL-12；

所述培养基A为含20%人AB血清的RPMI 1640培养基；所述培养基B为含IL-7的培养基，其中，所述IL-7的浓度含量为25-50ng/mL；所述培养基C为含有IL-2的培养基，其中，所述IL-2的浓度含量为10-20ng/mL。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中设置有阴性对照；所述阴性对照的刺激溶液为植物血凝素；所述植物血凝素的浓度为10-20μg/mL。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品包括脐带血、骨髓、外周血。

4.权利要求1-3任一所述的方法在IFN-γ细胞因子识别中的用途；

其中，所述用途不用于疾病诊断和治疗。