[发明专利]乙型肝炎病毒（HBV）特异性T细胞检测方法及其应用

说明书

本发明公开了一种HBV特异性T细胞检测方法及其应用。该发明针对现有技术只能对对应MHC分型的患者进行检测、HBV特异性T细胞频数低，很难检测到特异性T细胞的缺陷，在不构建抗原提呈细胞和antiCD28/CD49d或IL‑12的情况下，提取PBMC进行刺激，来检测HBV特异性T细胞。本发明不仅确定了试验中IL‑2的最适添加浓度和肽库的使用时机，节省了检测成本。

技术领域

本发明涉及细胞检测领域，具体涉及乙型肝炎病毒(HBV)特异性T细胞检测方法及其应用。

背景技术

HBV感染可导致严重肝病，包括急性和慢性乙型肝炎、肝硬化、肝癌。1990年至2015年之间，世界肝癌的发病率增加了75％，其中42％为HBV继发的相关肝细胞癌(HCC)。最新统计表明，病毒性肝炎已成为全球发病率和死亡率的第七大诱因，每年共计造成全球145 万人死亡，其死亡率远超艾滋病毒、疟疾和结核病。因此，消除慢性HBV感染者可以有效降低危及生命的并发风险。

研究表明，HBV特异性CD4⁺和CD8⁺ T细胞对清除HBV至关重要。但是，在现有研究中，与HBV控制相关的决定抗原诱导的T细胞反应仍未得到确定。

目前，常规的HBV体内试验多采用动物模型，但动物模型无法百分之百模拟人体清除病毒的机制，因此，对于慢性HBV感染的研究最好的实验对象为人体本身。

在95％以上具有免疫能力的成年人中，HBV感染是自限性的，在急性肝炎患者中可以检测到强烈的HBV特异性T细胞反应。但相反的是，对于慢性感染患者而言，由于T细胞耗尽，很少有慢性感染患者能自发清除HBV。研究表明，慢性HBV感染患者存在对HBV的特异性免疫反应功能异常的情况。HBV特异性T细胞反应低下的严重程度主要取决于病毒血症和HBV表面抗原(HBsAg)水平，这也代表了无法控制病毒复制和感染慢性化。由于HBV 慢性感染者HBV特异性T细胞的稀缺性，患者标本稀少而珍贵，所以亟需合适的HBV特异性T细胞的分布与功能的检测方法，以彻底剖析HBV慢性感染者体内HBV特异性T细胞的特点，为HBV相关预防与治疗提供相应的技术支持。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种HBV特异性T细胞检测方法；

本发明的另一目的在于提供上述检测方法在IFN-γ细胞因子识别中的用途。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供：

一种HBV特异性T细胞检测方法，该检测方法包括如下步骤：

分离样品中的外周血单个核细胞；

培养扩增上述的外周血单个核细胞；

取鼠抗人IFN-γ捕获抗体进行包被，洗涤，加入封闭液封闭；

去除封闭液，加入刺激溶液和上述扩增的外周血单个核细胞，孵育，洗涤，去除液体；

加入生物素化小鼠抗人IFN-γ单克隆抗体，孵育，去除生物素化小鼠抗人IFN-γ单克隆抗体，洗涤，去除液体；

加入山羊碱性磷酸酶抗生物素抗体，孵育，去除山羊碱性磷酸酶抗生物素抗体，洗涤，去除液体；

加入碱性磷酸酶进行显色反应，加水终止显色反应，烘干，判断T细胞肽库筛选结果；

检测T细胞肽库筛选结果为阳性的T细胞分泌细胞因子的水平；

其中，上述刺激溶液为肽库A溶液。

进一步地，上述检测方法中设置有阴性对照；上述阴性对照的封闭液为植物血凝素；上述植物血凝素的浓度为10-20μg/mL；优选地，植物血凝素的浓度为10μg/mL。