[发明专利]一种纳米酶标记直接竞争仿生免疫分析检测组胺的方法

权利要求书

1.一种纳米酶标记直接竞争仿生免疫分析检测风干虾中组胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)采用Pt@SiO₂纳米材料标记抗原，以PAF-45为支持载体的分子印迹聚合物作为仿生抗体，将Pt@SiO₂纳米材料标记抗原、仿生抗体和系列浓度梯度的组胺标样溶液混合，室温竞争反应30-50min，取上清液，加入TMB底物溶液进行显色反应，用酶标仪在450nm波长下读取紫外吸收值，计算抑制率；以组胺标样溶液浓度对数值为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制标准曲线；

(2)利用步骤(1)绘制的工作曲线对经前处理的待测物中的组胺含量进行检测；

步骤(1)中，所述以PAF-45为支持载体的分子印迹聚合物由如下方法制备而成：

将模板分子组胺二盐酸盐溶于二甲基亚砜中，加入甲基丙烯酸，进行预聚合反应，预聚合反应的时间是30min；再加入PAF-45材料、二甲基丙烯酸乙二醇酯和偶氮二异丁腈，搅拌均匀，得到混合溶液；超声脱气，在氮气环境下，水浴反应14～18h，反应结束后用甲醇-冰乙酸溶液索氏提取除去模板分子，得到分子印迹聚合物；

所述模板分子组胺二盐酸盐、甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸乙二醇酯和PAF-45材料加入的质量比为1：1.4：3.23：0.43～1.00；

所述PAF-45材料由如下方法合成：

将6g氯化铝和100mL的CHCl₃在250mL圆底烧瓶中混合剧烈搅拌6h，然后80℃加热30min；随后将40mL含有800mg联苯的CHCl₃溶液加入烧瓶中；持续加热40min后，将温度调至70℃，继续加热搅拌40min，冷却后过滤得到紫黑色粗品；然后，用50％的乙醇和50％的盐酸反复洗涤产物，去除剩余的联苯和AlCl₃；最后用水冲洗至中性，将其置于60℃的真空环境中过夜；

步骤(1)中，所述Pt@SiO₂纳米材料标记抗原由如下方法制备而成：

以PVP作为Pt@SiO₂纳米酶合成的稳定剂，将氯铂酸溶液与聚乙烯吡咯烷酮混合在乙醇溶液中，在100℃条件下加热回流3～4h，待冷却后，将成品放入4℃避光保存；

在Pt NPs溶液加入氨水作为催化剂，滴加硅酸四乙酯，在室温条件下反应2～4h，得到包覆二氧化硅的Pt@SiO₂；

对得到的Pt@SiO₂进行多次洗涤，除去过剩的硅酸四乙酯，然后在室温条件下滴加3-氨基丙基三乙氧基硅烷，反应3～6h，反应结束后，多次洗涤，得到修饰后的Pt@SiO₂纳米酶；

将氨基化的Pt@SiO₂材料和戊二醛混合0.5～1h；加入组胺溶液进行标记，反应结束后，离心分离，对反应物洗涤三次，得到Pt@SiO₂@HA；

步骤(2)中，所述前处理具体为：

向待测物中加入三氯乙酸溶液涡旋离心，重复提取2-4次，合并提取液，加入NaCl饱和后，用NaOH调节pH至12，用等比例的正丁醇-氯仿进行萃取，合并萃取液，40℃下氮气吹干，用5mL乙醇溶解残余物，0.22μm滤膜过滤；

所述待测物与三氯乙酸溶液加入量的比为5g：(10-20)mL。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述组胺标样溶液由乙醇配成而成，其梯度浓度分别为：0.1mg/L、0.5mg/L、2.5mg/L、12.5mg/L、60mg/L和300mg/L。