[发明专利]两株基因组高度同源猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒株感染性克隆构建、拯救与应用

说明书

两株基因组高度同源猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒株感染性克隆构建、拯救与应用，属于生物工程技术领域。本发明所构建的两个感染性克隆病毒是基于HP‑PRRSV基因组高度同源但毒力有显著差异的XJ17‑5强毒株和JSTZ1712‑12天然弱毒株。所构建感染性克隆的方法简单便捷，直接进行DNA转染，不需要体外转录成病毒RNA再转染，克服了RNA体外不稳定和易降解等缺点。所获得HP‑PRRSV感染性克隆平台可应用于体外病毒复制机制与致病机理研究。所构建HP‑PRRSV天然弱毒株感染性克隆病毒可用于研制更安全高效的新型PRRSV基因工程疫苗，有利于我国PRRSV的防控。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及两株猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒株感染性克隆构建、拯救、改造及其应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)引起的以母猪繁殖障碍和所有年龄猪呼吸道症状为主要特征的动物传染病，俗称“猪蓝耳病”。1987年，该病最早在美国报道，随后在全世界各地蔓延，严重危害养猪业的发展。1995年，我国首次分离到PRRSV。2006年，我国暴发“猪高热病”，引起高热(≥41℃)、50-100％发病率和20-100％死亡率，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。该病病原为毒力显著增强的高致病性PRRSV变异株(HP-PRRSV)。

PRRSV是一种单股正链RNA病毒，基因组大小约为15kb，5’端有帽子结构，3’端有Poly(A)尾，中间有10个开放阅读框(ORF)。ORF1a和ORF1b编码非结构蛋白，ORF2-7编码结构蛋白。PRRSV可分为PRRSV1和PRRSV2两个种(species)，每个种都可再细分为多个基因亚型(sub-genotypes)。我国的HP-PRRSV属于PRRSV2。HP-PRRSV的主要遗传标记是非结构蛋白2(nsp2)上存在30个氨基酸的不连续缺失。但是这一标志性缺失与HP-PRRSV高致病力无关。有研究表明，HP-PRRSV的高致病力与nsp9和nsp10相关。然而，HP-PRRSV毒力相关基因具体有哪些目前尚未完全阐明。

HP-PRRSV自2006年出现至今，一直是我国猪群中流行的优势毒株之一。HP-PRRSV引发疫情的防控是我国猪病防控的重点。此外，随着HP-PRRSV不断演化，新型变异毒株不断涌现，已呈现多样性并存态势。目前，疫苗免疫是有效防控PRRS的主要手段之一。PRRS灭活疫苗安全，但是免疫保护效果较差。PRRS弱毒疫苗同源保护效果好，但是交叉保护不佳。此外，由于现有HP-PRRSV商品化弱毒疫苗均由高致病力分离株体外传代致弱而来，存在毒力返强的风险，其安全性令人担忧。因此，研制更安全、更具交叉保护力的新型疫苗已成为我国PRRSV防控的重点。

RNA病毒感染性克隆是通过体外构建病毒cDNA分子克隆，进而在DNA水平上对病毒基因组进行人工操作，再通过转染易感细胞在体外拯救出具有感染性的病毒粒子。PRRSV感染性克隆的成功构建及遗传操作可用于病毒复制和致病机理解析以及新型基因工程疫苗研制等工作。尽管前人研究中已经建立了PRRSV经典毒株以及HP-PRRSV强毒株的反向遗传操作平台，然而，基因组高度同源但致病力却差异显著的HP-PRRSV变异毒株反向遗传操作平台至今未有报道。

发明内容

针对我国HP-PRRSV毒力决定因子尚未明确的科学问题，本发明提供两株基因组高度同源但致病力差异显著的HP-PRRSV感染性克隆病毒，为研究HP-PRRSV毒力决定因子提供关键生物学材料和遗传操作平台。同时针对目前缺乏安全、交叉保护好PRRS疫苗的实际问题，本发明的HP-PRRSV天然弱毒株的感染性克隆平台，还可用于研制更加安全高效的新型PRRSV基因工程疫苗。

本发明是通过以下技术方案实现的：