[发明专利]一种prep基因缺失型斑马鱼的构建方法

权利要求书

1.prep基因在构建肝脏再生缺陷斑马鱼模型中的应用，其特征在于，所述肝脏再生缺陷斑马鱼模型的构建方法包括如下步骤：

S1、查询斑马鱼prep基因的基因组DNA序列，并分析其功能结构域，根据CRISPR/Cas9敲除原理，在prep基因第3外显子找到prep基因的靶位点，序列为5’-GGTCTCGCACTGCTCCAGGAAGG-3’，并设计靶位点长引物和gRNA接头引物，靶位点长引物序列为5’-TaatacgactcactatagGGTCTCGCACTGCTCCAGGAAGG gttttagagctagaaatagc-3’；gRNA接头引物序列为5’-AGCACCGACTCGGTGCCACTT-3’；

S2、primer star PCR获得gRNA的体外转录模板：

S3、根据S2获得的gRNA的体外转录模板进行体外转录，并提取纯化，获得纯化的gRNA；

S4、将纯化的gRNA和Cas9蛋白显微注射至斑马鱼一细胞期的受精卵，培养获得稳定遗传prep纯合突变斑马鱼品系，即肝脏再生缺陷斑马鱼模型。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于， S2中，反应体系总体积50ul，体系如下：

gRNA cDNA1ul，靶位点长引物1ul，gRNA接头引物1ul，dNTP Mix 4ul，5×Primer starbuffer 10ul，Primer star酶1ul，ddH₂O 32ul。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于， S2中，反应程序为：

98℃2min；重复35个循环以下步骤：98℃15s，58℃15s，72℃20s；72℃5min；72℃30min。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于， S3中，反应体系为：

模板DNA10ul，10×RNA polymerase Reaction buffer2ul，25mM rNTP Mix 0.8ul，RNase Inhibitor 0.5ul，T7 RNA polymerase 2ul，RNase free H₂O4.7 ul。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于， S3中，反应程序为：

37℃，3小时。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，S4的培养具体包括以下步骤

S1、将显微注射的受精卵培养孵化，Sanger测序检测靶位点的有效性，筛选出有基因突变的，记作F0代，饲养至成鱼；

S2、将F0代成鱼与WT侧交得到F1代；

S3、利用基因型鉴定的方法确定prep基因敲除的F1代突变体；

S4、从F1代突变体中挑选相同突变类型的F1代进行交配得到F2代；

S5、基因型鉴定F2代中prep基因敲除的纯合子即为能稳定遗传prep纯合突变斑马鱼品系，即肝脏再生缺陷斑马鱼模型。