[发明专利]一种prep基因缺失型斑马鱼的构建方法

说明书

本发明涉及斑马鱼模型技术领域，具体涉及一种prep基因缺失型斑马鱼的构建方法。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，在斑马鱼的prep基因上设计打靶位点，在体外合成的特异性gRNA和Cas9‑蛋白，显微共注射进入斑马鱼一细胞内，胚胎培养48h后，通过选取胚胎进行基因型分析，从而证实了所选位点的有效性。本发明成功构建的prep基因缺失型斑马鱼可作为研究肝脏再生缺陷的模型，并应用于筛选治疗治脏再生缺陷的药物。

技术领域

本发明涉及斑马鱼模型技术领域，具体涉及一种prep基因缺失型斑马鱼的构建方法。

背景技术

脯氨酰内肽酶Prolyl endopeptidase(prep)是一种能特异性水解多肽链中脯氨酸残基羧基端肽键的非常保守的丝氨酸肽酶，在rat和mice脑部早期发育过程中，prep基因发挥着非常重要的作用，在脑部的各个部位包括大脑皮层，海马区，下丘脑，小脑和骨髓神经上皮等都有高表达，以及通过促进小脑神经元细胞的增殖和分化调控小脑的发育。除此之外prep也在一些与脑部神经系统相关的疾病样品中被检测到。这些研究表明prep对于机体脑部的发育与疾病密切相关。也有报道表明小鼠下丘脑的脯氨酰内肽酶调控胰腺中的胰岛素和胰高血糖素的分泌，prep还具有另外一个同源蛋白脯氨酰羧肽酶prolylcarboxypeptidase(PRCP)，它们发挥着同样的功能，在人类胰腺癌细胞中，prep与prcp调控胰岛素受体IRS-1激活PI3K/AKT/mTOR信号通路从而促进细胞的增殖和生存，这暗示prep可以通过IRS-1-PI3K信号轴调控糖类代谢，细胞增殖和细胞生存。除此之外，在胚胎早期发育过程中，prep在很多组织器官(例如肺，心脏，肾脏和肝脏)中都有被检测出高表达，也参与哺乳动物生殖功能的调控。prep在组织器官发育过程中发挥着非常重要的功能，但是其调控的具体分子机制知之甚少，以及prep在器官再生尤其肝脏再生过程中基本没有报道。

基于此，提供一种prep基因缺失型斑马鱼的构建方法，提高对prep基因的研究显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种prep基因缺失型斑马鱼的构建方法，本发明中，prep基因在脑部的各个部位包括大脑皮层，海马区，下丘脑，小脑和骨髓神经上皮等都有高表达，prep与机体脑部的发育与疾病密切相关，以及prep在器官再生，尤其肝脏再生过程中起作用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种prep基因缺失型斑马鱼的构建方法，包括如下步骤：

S1、查询斑马鱼prep基因的基因组DNA序列，并分析其功能结构域，根据CRISPR/Cas9敲除原理，在prep基因第3外显子找到prep基因的靶位点，序列为5’-GGTCTCGCACTGCTCCAGGAAGG-3’，并设计靶位点长引物，靶位点长引物序列为5’-Taatacgactcactatag GGTCTCGCACTGCTCCA GGAAGG gttttagagctagaaatagc-3’，gRNA接头引物序列为5’-AGCACCG ACTCGGTGCCACTT-3’。

S2、primer star PCR获得gRNA的体外转录模板；

S3、根据S2获得的gRNA的体外转录模板进行体外转录，并提取纯化，获得纯化的gRNA；

S4、将纯化的gRNA和Cas9蛋白显微注射至斑马鱼一细胞期的受精卵，培养获得稳定遗传prep纯合突变斑马鱼品系，即prep基因缺失型斑马鱼。

进一步的，S2中，反应体系总体积50ul，体系如下：

gRNA cDNA1ul，靶位点长引物1ul，gRNA接头引物1ul，dNTP Mix 4ul，5×Primerstar buffer 10ul，Primer star酶1ul，ddH₂O 32ul。

进一步的，S2中，反应程序为：