[发明专利]一种利用大肠杆菌全生物合成丙二酸的方法

权利要求书

1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，以葡萄糖为原料，由草酰乙酸-天冬氨酸途径合成丙二酸；所述重组大肠杆菌分模块表达了磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸转氨酶、琥珀酸半醛脱氢酶、天冬氨酸-α-脱氢酶和β-丙氨酸丙酮酸转氨酶；所述分模块表达是将磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因ppc和天冬氨酸转氨酶基因aspC共表达，将天冬氨酸-α-脱氢酶基因panD单独表达，将琥珀酸半醛脱氢酶基因yne1和β-丙氨酸丙酮酸转氨酶基因pa0123共表达；

所述磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述天冬氨酸转氨酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述天冬氨酸-α-脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述β-丙氨酸丙酮酸转氨酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述琥珀酸半醛脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主。

3.一种构建权利要求1或2所述重组大肠杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）以质粒pCDFDuet-1为骨架载体，连接基因片段ppc和aspC，得到重组质粒pCDF-ppc-aspC；

（2）以质粒pTrc99a为骨架载体，连接基因片段panD，得到重组质粒pTrc99a-panD；

（3）以质粒pRSFDuet-1为骨架载体，连接基因片段yne1、pa0123，得到重组质粒pRSF-yne1-pa0123；

（4）将pCDF-ppc-aspC、pTrc99a-panD和pRSF-yne1-pa0123共同转入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组大肠杆菌。

4.一种发酵生产丙二酸的方法，其特征在于，将权利要求1或2所述的重组大肠杆菌接种于含葡萄糖的培养基中，于在有氧的环境下，35~37℃发酵至少24 h。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将所述重组大肠杆菌于35~37℃、200~280rpm培养至OD₆₀₀为0.8-1.0时加入IPTG，于28~30℃诱导培养至少24 h。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌还经过种子液培养；所述种子液培养是将所述重组大肠杆菌在LB培养集中培养至OD₆₀₀达到0.8-1.0，获得种子液，再接种至发酵培养基中发酵。

7.权利要求1或2所述的重组大肠杆菌或权利要求4~6任一所述方法在制备丙二酸及含丙二酸的产品方面的应用。