[发明专利]一种利用大肠杆菌全生物合成丙二酸的方法

说明书

本发明公开了一种利用大肠杆菌全生物合成丙二酸的方法，属于生物工程领域。本发明是以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，将大肠杆菌自身的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因和天冬氨酸转氨酶共表达，将来自谷氨酸棒杆菌的天冬氨酸‑α‑脱氢酶基因单独进行表达，将大肠杆菌自身的琥珀酸半醛脱氢酶基因和来自铜绿假单胞菌的异源基因β‑丙氨酸丙酮酸转氨酶基因共表达，构建了经由草酰乙酸‑天冬氨酸的丙二酸全生物合成途径，使工程菌积累丙二酸的能力进一步提高，发酵36小时丙二酸产量可达0.74g/L，较前期构建菌株丙二酸最高产量0.23g/L提高了3倍，发酵时间提前了12小时。

技术领域

本发明涉及一种利用大肠杆菌全生物合成丙二酸的方法，属于生物工程领域。

背景技术

丙二酸主要用于香料、胶粘剂和树脂添加剂等的生产，也可用于皮革制品或铝制品表面处理剂、泡沫塑料发泡剂和核反应器的化学清洗剂，如丙二酸是生产农药杀菌剂富士一号、除草剂枯杀达、植物生长调节剂吲熟酯的原料；医药行业使用丙二酸制备利尿药苯磺唑酮、抗炎药羟苯保泰松、镇静药溴甲辛托品等；丙二酸加热后生成二氧化碳和水，没有污染问题，所以可直接用作铝表面处理剂。此外，丙二酸及其酯类也可广泛应用作医药中间体，丙二酸的两个羧基中的羟基全被乙氧基取代而生成的化合物丙二酸二乙酯或丙二酸二乙酯是重要的有机合成原料，用于染料和药物合成，如制造巴比妥类药物，维生素B1和B6等。随着目前国内和国际化工行业的快速发展，加上丙二酸的用途的大力开发，丙二酸的产量和品质在日剧上升。

丙二酸现在应用于实际生产中的主要合成方法为化学合成法。主要有两种生产路线，一是丙二酸酯用硫酸在80-90℃水解，该法特点是工艺路线及生产周期短、三废少，但该水解过程属于可逆反应，且丙二酸受高温容易发生脱羧反应分解生成乙酸、水和二氧化碳，故产品收率低，但该方法易控制杂质的产生，所以产品的纯度较高；二是二是酯交换工艺，只要控制原料的纯度，就可以制备含量高、杂质少、水份低的高纯度丙二酸且得到的副产可以制备纯度较高的乙酸乙酯，此法的缺点是：需要用到乙酸、有刺鼻酸味、另有副产乙酸乙醋和乙醇的混合溶液产生，不好处理。

丙二酸的生物合成途径还没有得到很好的发展，已知的方法是通过丙二酰-CoA水解酶活性从丙二酰-CoA产生丙二酸的方法(WO 2013134424)。但是，丙二酰-CoA途径的代谢物生产效率比天冬氨酸途径低，因此，利用天冬氨酸途径生产丙二酸是一种效率更高的方法。

发明内容

针对上述问题，本发明的第一个目的是提供一种由草酰乙酸-天冬氨酸途径生物合成丙二酸的重组大肠杆菌，所述大肠杆菌分模块过量表达来自大肠杆菌的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，天冬氨酸转氨酶，琥珀酸半醛脱氢酶，来自谷氨酸棒杆菌的异源基因天冬氨酸-α-脱氢酶和来自铜绿假单胞菌的异源基因β-丙氨酸丙酮酸转氨酶。

在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主。

在一种实施方式中，所述分模块过量表达是将基因ppc和aspC共表达，将基因panD单独表达，将基因yne1和pa0123共表达。

在一种实施方式中，所述大肠杆菌以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，分模块过量表达来自大肠杆菌的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppc)，天冬氨酸转氨酶基因(aspC)，琥珀酸半醛脱氢酶基因(yne1)，来自谷氨酸棒杆菌的异源基因天冬氨酸-α-脱氢酶基因(panD)和来自铜绿假单胞菌的异源基因β-丙氨酸丙酮酸转氨酶基因(pa0123)。

在一种实施方式中，所述磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppc)的核苷酸序列如SEQID NO.1所示；氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

在一种实施方式中，所述天冬氨酸转氨酶基因(aspC)的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

在一种实施方式中，所述天冬氨酸-α-脱氢酶基因(panD)的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。