[发明专利]一种废水的发育神经毒性评估方法

权利要求书

1.一种废水的发育神经毒性评估方法，其特征在于，将huc:eGFP转基因斑马鱼胚胎暴露于待检测的废水中至24 hpf，将暴露后的胚胎取出后，于荧光倒置显微镜下观察，并采集图像进行分析；

其中，将废水预处理后得到待检测的废水，所述的预处理包括：（1）调节pH；（2）过滤杂质；（3）将野生型斑马鱼胚胎暴露于废水中，记录胚胎死亡情况，根据胚胎死亡情况评估结果，对废水进行浓缩或稀释至0%＜致死率≤20%；

其中，所述的分析为从采集的图像中直接观察，绿色荧光表达越弱，所对应的废水对发育神经的毒性越大，或，所述的分析为通过图像处理软件将采集所得到的图转化为灰度图像，通过计算平均灰度对荧光值进行半定量，荧光值越小，所对应的废水对发育神经的毒性越大。

2.根据权利要求1所述的废水的发育神经毒性评估方法，其特征在于，所述的huc:eGFP转基因斑马鱼胚胎的获取方法包括如下步骤：

S1：将huc:eGFP转基因斑马鱼成鱼饲养于鱼缸中，雌鱼和雄鱼要分开养殖，其养殖条件均一样：水温为28℃，光照周期为14 h光照，10 h黑暗，养殖密度为5-8尾/L，每天中、晚各喂食一次虾；

S2：每天第二次喂食结束后30 min后进行配鱼，鱼缸盛水量为鱼缸体积的三分之二，每个鱼缸中为两雌一雄或一雌一雄，鱼缸中间用隔板将雌雄分开，次日光照开启时抽去隔板，13~20 min雌鱼开始排卵，在30~40 min 时收集胚胎，去除死卵、粪便和其它杂物，用E3培养基洗涤数次，转移到28.5°C恒温培养箱中待用；

其中，所述的E3培养基中，各组分的浓度为：5 mM NaCl，0.17 mM KCl，0.33 mM CaCl₂·2H₂O，0.33 mM MgSO₄·7H₂O；溶剂为水，pH为7.2~7.4。

3.根据权利要求1所述的废水的发育神经毒性评估方法，其特征在于，步骤（1）中，将废水的pH调节为7.0~7.6。

4.根据权利要求1所述的废水的发育神经毒性评估方法，其特征在于，步骤（2）中，将步骤（1）处理后的废水先通过0.45 μm的滤膜过滤，将滤液再通过0.22 μm的滤膜过滤。

5.根据权利要求1所述的废水的发育神经毒性评估方法，其特征在于，步骤（3）中，将野生型斑马鱼胚胎移入孔板中，每孔10颗，移除孔板中胚胎的培养液，再向孔板中加入2 mL步骤（2）处理后的废水，使得转基因斑马鱼持续在废水中暴露至24 hpf，观察计算胚胎的致死率；

若致死率为0%，则将步骤（2）处理废水浓缩后用于暴露实验，直至0%＜致死率≤20%；若致死率高于20%，则将步骤（2）处理废水用E3培养基稀释，直至0%＜致死率≤20%，即得待检测的废水；

其中，所述的E3培养基中，各组分的浓度为：5 mM NaCl，0.17 mM KCl，0.33 mM CaCl₂·2H₂O，0.33 mM MgSO₄·7H₂O；溶剂为水，pH为7.2~7.4。

6.根据权利要求1所述的废水的发育神经毒性评估方法，其特征在于，所述的暴露为将huc:eGFP转基因斑马鱼胚胎移入孔板中，每孔10颗，移除孔板中胚胎的培养液，再向孔板中加入2 mL废水，使得转基因斑马鱼持续在废水中暴露至24 hpf。