[发明专利]一种筛选检测少弱精症相关蛋白标志物的方法及其应用

权利要求书

1.一种筛选检测少弱精症相关蛋白标志物的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)提取精子细胞全蛋白；

(2)将精子细胞全蛋白利用基于超滤辅助样品制备方法进行酶解，对酶解后的肽段进行脱盐，制备得到样品混合肽段；

(3)对步骤(2)的样品混合肽段采用高效液相色谱进行分离得各分离样品；

(4)将步骤(3)获得的分离的样品采用纳流液相色谱-串联质谱分析；

(5)对质谱数据进行UNIPROT数据库检索，以检测特异肽段数进行初筛，然后以BSA蛋白信号强度为标准，计算每个样本中蛋白的相对检测丰度；将正常个体与少弱精个体的蛋白按照其相对检测丰度进行筛选，从而得到差异蛋白，从而得到少弱精症相关蛋白标志物。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，提取精子细胞全蛋白的具体方法包括：

将精子样本采用DPBS洗涤，加入RIPA裂解液超声，置于低温孵育裂解，离心，取上层蛋白质清液，测定清液中蛋白浓度；

优选的，加入RIPA裂解液超声1～2min；

低温孵育裂解具体为：置于冰上孵育20～30min裂解；

离心具体方法为：在12,000～15,000g离心10～30min；优选为14,000g离心20min。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，利用基于超滤辅助样品制备方法对蛋白进行酶解具体为：

在超滤管中加入上述上层蛋白质清液，震荡，离心，加入尿素，继续震荡离心；加入NH₄HCO₃震荡离心；更换超滤管套管，加入BSA，并加入NH₄HCO₃溶液，再加入胰蛋白酶，过夜消化。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，对酶解后的肽段进行脱盐采用ziptip法进行。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，高效液相色谱分离具体方法为：

样品混合肽段用A相溶解后过柱分离，流动相梯度设置为：0-3min，100％A相，3-25min，流速始终保持为0.7mL/min；紫外检测器UV设置为214nm，根据样品分离的色谱图，在10min时离心管收集液相分离馏分，每管收集1min，并按照收集的时间顺序对组分编号；将组分真空干燥；用乙腈水混合液溶解并交叉合并，将最终得到的组分真空干燥，低温贮存备用；

优选的，过柱采用色谱柱为C18 XBridge BEH-130柱；

优选的，流动相中，

A相：2％CH₃CN，98％H₂O，NH₃H₂O调pH 10.0；

B相：98％CH₃CN，2％H₂O。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，采用纳流液相色谱-串联质谱分析具体方法为：

每个样品分别用A相溶解，样品分离之前分别用A相平衡自制的预柱和分析柱；平衡后样品在A相的带动下首先载样于预柱，然后在不同梯度下进行液相分离；

150min色谱梯度变化如下：5-32％流动相B 100min，32-80％流动相B，20min，80％流动相B，30min.流速始终保持在300nL/min。

质谱检测条件：350-1800m/z的全扫描，分辨率为60,000(m/z 200)。二级图谱扫描时，活化时间为10ms，隔离宽度为2m/z。碎裂方式为诱导碰撞解离，归一化碰撞能量设定为35％，动态排出时间为90s；

纳流液相色谱分离：A相：10％CH₃CN，90％H₂O，1％甲酸；B相：1％甲酸溶解在90％CH₃CN，10％H₂O。