[发明专利]一种筛选检测少弱精症相关蛋白标志物的方法及其应用

说明书

本发明提供一种筛选检测少弱精症相关蛋白标志物的方法及其应用，属于生物医学和分子诊断技术领域。本发明首先对正常和病人精子蛋白进行提取酶解，然后以牛血清白蛋白(BSA)为标准品利用高分辨生物质谱和非标记定量蛋白质组学方法对多组重度少弱精疾病的精子蛋白进行深度的质谱分析；然后利用蛋白定量分析方法对质谱数据进行搜索，尽可能大量的鉴定出精子中蛋白质；最后通过正常和病人精子蛋白组的比较，得到与重度少弱精症相关的蛋白，从而将其作为重度少弱精症的蛋白标志物，筛选检测方法目标明确，试验结果准确可靠，因此具有良好的实际应用之价值。

技术领域

本发明属于生物医学和分子诊断技术领域，具体涉及一种筛选检测少弱精症相关蛋白标志物的方法及其应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

不孕不育已成为全世界范围内的生殖健康问题，其中由于男性因素造成的不育大概占50％左右，且近年来呈上升的趋势。造成男性不育的主要原因是少精弱精症。根据世界卫生组织的定义，弱精子症是指精液中前向运动的精子少于32％。弱精子症是男性不育的主要原因之一。弱精子症约占男性不育的19％，而少精弱精或畸形弱精子症占男性不育的63％。尽管许多因素如生活方式、环境污染、精索静脉曲张以及感染等可能会导致弱精子症。但是遗传因素也是不可忽视的原因。

目前关于精子蛋白质组的研究已有报道。Saraswat等利用UPLC-MS的方法在人类精子中定量了667个蛋白，并且分析出了20个健康人和弱精症患者精子中的差异蛋白。最新更新的人类精子蛋白质组共6198个蛋白。Gaigai Wang等利用高分辨质谱在人类精子中鉴定出4675个蛋白。蛋白质是生命活动的分子基础，将疾病状态下异常的或者数量变化极大的特异蛋白作为疾病的生物标志物进而用于诊断疾病的进程具有重要意义。因此，有必要提供一种简单易行、高通量的基于蛋白质组学对少弱精症相关蛋白进行筛选检测。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本发明目的在于提供一种筛选检测少弱精症相关蛋白标志物的方法及其应用。本发明首先对正常和病人精子蛋白进行提取酶解，然后以牛血清白蛋白(BSA)为标准品利用高分辨生物质谱和非标记定量蛋白质组学方法对多组重度少弱精疾病的精子蛋白进行深度的质谱分析；然后利用蛋白定量分析方法对质谱数据进行搜索，尽可能大量的鉴定出精子中蛋白质；最后通过正常和病人精子蛋白组的比较，得到与重度少弱精症相关的蛋白，从而将其作为重度少弱精症的蛋白标志物，筛选检测方法目标明确，试验结果准确可靠，因此具有良好的实际应用之价值。

为了实现上述技术目的，本发明的技术方案为：

本发明的第一个方面，提供一种筛选检测少弱精症相关蛋白标志物的方法，所述方法包括：

(1)提取精子细胞全蛋白；

(2)将精子细胞全蛋白利用基于超滤辅助样品制备(FASP)方法进行酶解，对酶解后的肽段进行脱盐，制备得到样品混合肽段；

(3)对步骤(2)的样品混合肽段采用高效液相色谱(HPLC)进行分离得各分离样品；

(4)将步骤(3)获得的分离的样品采用纳流液相色谱-串联质谱分析；

(5)对质谱数据进行UNIPROT数据库检索，以检测特异肽段数进行初筛，然后以BSA蛋白信号强度为标准，计算每个样本中蛋白的相对检测丰度；将正常个体与少弱精个体的蛋白按照其相对检测丰度进行筛选，从而得到差异蛋白，从而得到少弱精症相关蛋白标志物。

本发明的第二个方面，提供上述筛选检测方法获得的少弱精症相关蛋白标志物。

所述少弱精症相关蛋白标志物包括但不限于ACPP、ACRBP、AKAP3、AKAP4、AZGP1、SPACA1、PDHA2和TUBA3C。