[发明专利]一种用于illumina二代测序平台的标准品

权利要求书

1.一种用于illumina二代测序平台的标准品，其特征在于，标准品由以下步骤制备：

S1、引物设计：

Primer-F： AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC【i5-index】ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT；

Primer-R： CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT【i7-index】GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT；

其中i5-index和i7-index的序列分别为GCTCTCTA和ATGATTCA

S2、PCR扩增：

用PCR扩增的方法，在Phix文库测序接头中添加i5和i7双端index标签，构建了Phix-i5-i7标准品文库；

(1)、PCR扩增体系：

使用DNA聚合酶Taq DNA Polymerase进行PCR扩增，扩增体系如下：

10×Taq Buffer为5μl、dNTP Mix 10mM each为1μl、10μM Primer- F为2μl、10μMPrimer- R为2μl、5U/μl Taq DNA Polymerase为0.5μl、10ng/ul Template DNA为1μl、Nuclease-free Water To 50μl；

(2)、PCR扩增程序：

95℃预变性3min；95℃变性30sec， 56℃退火30sec，72℃延伸45sec，共15个循环；最后72℃延伸5min；4℃保存；

(3)、产物纯化：

①、纯化前将磁珠液提前30min从2～8℃取出，静置使其温度平衡至室温；

②、旋涡振荡使磁珠液充分混匀，吸取40μl磁珠液加入50μl DNA扩增产物中，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀，室温孵育10min，使DNA结合到磁珠上；

③、将样品置于磁力架上，待溶液澄清后，5min，小心移除上清；

④、保持样品始终处于磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清；

⑤、再次加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清；

⑥、保持样品始终处于磁力架上，室温下开盖干燥磁珠5-10min；

⑦、将样品从磁力架上取出，加入50μl Nuclease-free Water，涡旋振荡或使用移液器吹打充分混匀，室温静置2min；

⑧、在磁力架上静置5min待溶液澄清后，小心吸取上清至一个新的无核酸酶离心管中，做好标记待用

S3、文库质控。

2.根据权利要求1所述的一种用于illumina二代测序平台的标准品，其特征在于：所述步骤S3中的文库质控步骤为：

(1)、使用Agilent 4200TapeStation检测Phix-i5-i7文库扩增片段大小、是否存在引物二聚体污染；

(2)、使用实时荧光定量PCR：QuantStudio 6Flex Real-Time PCR System检测Phix-i5-i7文库浓度，Phix-i5-i7文库浓度为39.58nM。