[发明专利]一种用于illumina二代测序平台的标准品

说明书

本发明涉及分子生物学技术二代测序技术领域，且公开了一种用于illumina二代测序平台的标准品，包括以下步骤：S1、引物设计；S2、PCR扩增；S3、文库质控；S4、上机测序；通过使用自行设计的扩增引用，用PCR扩增的方法，在Phix文库测序接头中添加i5和i7双端index标签，构建了Phix‑i5‑i7标准品文库。原illumina的Phix文库由于没有index标签，无法进行数据拆分质控，仅能用于平衡测序文库池碱基分布，保证高质量测序数据。本发明中Phix‑i5‑i7标准品文库保留了原本Phix文库测序区段碱基序列，依然可用于平衡测序混池碱基分布，保证高质量测序数据；同时可通过i5‑i7双端index标签对Phix文库进行数据拆分质控，通过Phix文库下机质控数据评估本次测序过程中仪器、试剂是否存在异常因素。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术二代测序技术领域，具体为一种用于illumina二代测序平台的标准品。

背景技术

随着测序技术的快速发展，测序成本称超摩尔定律水平下降，吸引着越来越多的科研工作着使用测序平台助力科研事业。众多测序平台中，目前最经典最大众的测序平台是illumina二代高通量测序平台。由于测序平台的技术局限，illumina二代高通量测序平台对测序文库碱基平衡性要求很高，而很多通过固定区域捕获技术得到的文库或者某种特殊结构的文库，测序碱基随机性较差，会严重影响测序质量，为保证高质量测序数据，illumina平台推出碱基平衡的文库Phix作为测序标准品，按比例添加到待测序的混池文库中，用于改善待测序文库的碱基随机性。但是由于illumina公司Phix文库不含index，后续数据拆分困难，很难作为质控品来评估整个测序状态是否正常。

为了能使Phix文库在测序过程中既能起到平衡碱基的作用，又能作为质控品，评估测序状态是否正常。我们在不破坏Phix文库碱基平衡性的前提下对现有illumina Phix文库进行DNA分子改造，构建了Phix-i5-i7含双端index标签的标准品文库，使标准品文库不仅能起到平衡测序混池文库碱基分布问题，同时可通过index标签对标准品文库进行数据拆分质控，通过Phix文库测序质量评估测序状态是否正常，为后续测序异常问题溯源提供了可靠依据。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于illumina二代测序平台的标准品，解决了上述背景技术中所提出的问题。

(二)技术方案

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于illumina二代测序平台的标准品，包括以下步骤：

S1、引物设计；

S2、PCR扩增；

S3、文库质控；

S4、上机测序；

S5、下机数据分析质控。

优选的，所述步骤S1中的引物为：

Primer-F:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC【i5-index】ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT；

Primer-R:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT【i7-index】GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT；

其中i5-index和i7-index的序列分别为GCTCTCTA和ATGATTCA。

优选的，所述步骤S2中的PCR扩增步骤为：

(1)、PCR扩增体系：