[发明专利]T7EI-like核酸酶反应缓冲体系、DNA错配检测方法及应用

权利要求书

1.一种T7EI-like核酸酶反应缓冲体系，其特征在于，该反应缓冲体系包括T7EI-like核酸酶、缓冲试剂、去垢剂、催化金属离子、稳定剂和DNA连接酶；

所述缓冲试剂采用Tris-盐酸或Tris-醋酸中的一种；

所述去垢剂采用Triton X-100和/或Tween-20；

所述催化金属离子的金属离子包括Mg²⁺、Co²⁺或Mn²⁺中的一种或多种；

所述稳定剂包括BSA。

2.如权利要求1所述T7EI-like核酸酶反应缓冲体系，其特征在于，所述T7EI-like核酸酶，包括来自于大肠杆菌T7噬菌体的T7EI核酸酶，以及与T7EI核酸酶同源且催化特性类同的其它核酸酶；或者包括来自蓝细菌P-SSP7噬菌体的P-SSP7EI核酸酶，以及与P-SSP7EI核酸酶同源且催化特性类同的其它核酸酶。

3.如权利要求1所述T7EI-like核酸酶反应缓冲体系，其特征在于，所述缓冲试剂的终浓度为20～50mM，pH在7.4～9.0之间；

所述去垢剂用于增强酶蛋白分散度，Triton X-100的体积浓度为0.1～0.5％，或Tween-20的体积浓度为0.02～0.1％；

所述金属离子用于参与底物结合和催化，浓度为2～10mM；

所述稳定剂为增强酶稳定性的非特异蛋白，浓度为10～100ng/ml；

所述DNA连接酶用于抵消T7EI-like核酸酶非特异性切割活力，包括T4-ligase、Taq-ligase以及Ecoli-ligse中的一种，还包括底物ATP或NAD⁺。

4.一种DNA错配检测方法，其特征在于，

首先，对待检测的DNA样品进行前处理，依次包括将待检测的DNA样品或待测DNA样品和已知DNA样品变性退火形成错配DNA、DNA沉淀两个步骤；

接着，将上一步得到的产物加入到权利要求1-3中任意一个权利要求所述T7EI-like核酸酶反应缓冲体系中，温浴反应一段时间进行错配识别切割后电泳检测，根据电泳检测结果判断待检测的DNA样品中是否存在错配；

如果错配DNA的类型为InDel型，则不需要DNA沉淀步骤。

5.权利要求1所述T7EI-like核酸酶反应缓冲体系在基因编辑中的应用；所述T7EI-like核酸酶反应缓冲体系对InDel和SNP两种类型变异均能较好识别，能更全面地评价基因编辑效率；在基因编辑个体筛选过程中，利用该优化的反应缓冲体系能筛选出原来可能忽略的SNP型变异。

6.权利要求1所述T7EI-like核酸酶反应缓冲体系在以T7EI-like核酸酶切割为基础的序列变异检测、筛查、追踪技术中的应用；样本序列间的差异来源不限于基因编辑产生，还包括天然个体差异或其它化学物理方法导致的变异。通过PCR进行定点突变时，利用所述T7EI-like核酸酶反应缓冲体系消除未突变前的少量DNA污染；利用Tilling技术筛查个体在特定基因中的变异时，所述T7EI-like核酸酶反应缓冲体系用于增强T7EI-like核酸酶对SNP型变异筛查效率；利用T7EI-like核酸酶所述反应缓冲体系可以将任何InDel或SNP型变异转化为分子标记，应用于规模化分子育种和优良性状跟踪聚合；理论上所述T7EI-like核酸酶反应缓冲体系可应用于任意同源序列间InDel和SNP型变异的发现、筛查、追踪的研究和应用。