[发明专利]T7EI-like核酸酶反应缓冲体系、DNA错配检测方法及应用

说明书

本发明公开了一种T7EI‑like核酸酶反应缓冲体系、DNA错配检测方法及应用，涉及一种T7EI‑like核酸酶的反应缓冲溶液配方，以及利用该缓冲体系增强该类核酸酶错配识别切割能力的应用。常规的反应缓冲体系中，T7EI‑like核酸酶对插入缺失(InDel)导致的错配DNA具有较好的识别切割能力，而对单核苷酸多态性(SNP)导致的错配DNA的识别切割能力较差；本发明的反应缓冲体系中，T7EI‑like核酸酶对两类错配DNA均有良好的识别切割能力。该反应缓冲体系的核心在于其特定的缓冲溶质配比、去垢剂浓度、二价金属离子及辅助蛋白配比。该发明可应用于基因编辑效率的检测、DNA样品中错误序列的消除、基因编辑个体的筛查、样本中InDel和SNP位点的检测筛选、将InDel和SNP位点转化为分子标记进行分子辅助育种。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及分子生物学、基因工程和生物技术应用，具体涉及一种增强T7EI-like核酸酶错配切割能力的方法及应用。

背景技术

物种和个体之间的差异由其基因组和基因序列中的差异决定，快速筛选判断同源序列之间是否存在差异及差异的实质是分子生物学研究和生物技术领域重要议题，相关研究方法和技术不仅在医学和农业领域具有广泛的应用前景，同时具有巨大的市场价值。

无论是自然进化、人工诱变或者定向编辑产生的同源序列变异，其序列间的差异可分为插入缺失(InDel)和单核苷酸多态性(SNP)两大类。如何检测不同个体间同源序列间是否存在差异？目前主流的方法有三种：其一是PCR+电泳法，首先通过PCR扩增获得目标DNA片段，然后通过高分辨率电泳检测序列长度和序列本身是否存在差异，长片段的InDel型差异相对容易检测，如果InDel的长度过短，需要通过极高分辨率的测序胶才能分辨，SNP型的差异需要通过变性电泳分析单链构象多态性(SSCP)，该技术操作难度则更大。其二是PCR+错配切割法，同样先进行PCR扩增，然后将待检测DNA片段和已知DNA片段进行变性退火，如果两序列间存在差异，则会形成错配，然后加入特异识别错配位点的核酸酶进行切割，该方法通过特异酶的切割，将错配信号进行转化。常用于错配识别的核酸酶包括来自T7噬菌体的T7EI(T7 endonuclease I)和芹菜的CEL I核酸酶，前者识别InDel型错配的能力更强，后者识别SNP的能力更好。其三是PCR+测序，通过测序可以最终明确序列之间的差异，但相对成本较前两者要高许多。上述方法各有优缺点，又有各自的应用领域。

T7EI是T7噬菌体基因3的编码产物，是一种多功能结构特异性核酸酶(NP_041972.1)，可以识别并切割Holiday DNA、错配DNA和切刻(nick)DNA。错配DNA包括前面提到的InDel型和SNP型。T7EI识别Holiday DNA的活力最强，其次是InDel型错配，其识别SNP型错配的能力较弱。T7EI还有随机切刻(random nick)活性和切刻位点切割(nick-sitecleavage)活性。P-SSP7EI(P-SSP7 endonuclease I，YP_214193)是由蓝细菌噬菌体P-SSP7基因3编码的T7EI同源蛋白，该蛋白具有T7EI类似的Holiday DNA和错配DNA识别和切割活性，但其nick-site切割活性与T7EI具有很大差异[5]。

T7EI自发现以后便应用于突变检测，随着人们对序列变异检测需求的不断增加，基因编辑技术的兴起，其应用更加广泛。目前市面上既有单独销售的T7EI，也有基于该酶开发的各种试剂盒。如NEB公司基于该酶开发的基因编辑检测试剂盒EnGen MutationDetection Kit，Clonetech公司开发的Guide-it InDel Identification Kit。