[发明专利]用于培养MDCK细胞系的培养基及其制备方法

说明书

本发明涉及细胞培养领域，特别涉及用于培养MDCK细胞系的培养基及其制备方法，包括基础代谢营养物类、微量元素类、维生素类、盐类、脂质体、添加物等。制备方法简单，成本低，便于操作。制得的培养基能支持MDCK细胞悬浮培养，促进MDCK细胞生长，而且安全性好，培养的MDCK细胞系可应用于禽流感疫苗的生产中。

背景技术

禽流感(Bird Flu或Avian Influenza）是由甲型流感病毒的亚型(也称禽流感病毒）引起的一种急性传染病，能够感染人类，且人感染禽流感后的死亡率在30％以上。目前为止禽流感仍未找到理想的治疗药物，疫苗接种仍是当今防止疫病发生和流行的最有效手段。

禽流感疫苗的传统生产工艺是鸡胚培养法，这种以鸡胚作为生产基质的方式已使用多年，工艺成熟，但生产周期长、操作繁琐、工作量大、易污染，如遇禽流感大规模爆发，鸡胚的供应存在很大问题。以细胞作为介质是目前疫苗制备的趋势，犬肾(Madin-Darbycanine kidney cells，MDCK）细胞由Madin和Darby分离培育建立，培养容易、增殖快、流感病毒感染效率高，是国内外公认的最适合禽流感病毒培养的细胞系。其通常是以贴壁培养生长，细胞之间互相衔接或呈镶嵌状排列，并会在表面集合形成紧密的连接蛋白，从而形成单层贴壁细胞。

但是，该培养方式存在一些缺陷，比如贴壁培养受基质表面积限制导致病毒产量下降；贴壁培养过程中换液等程序较为复杂繁琐，血清的使用易受微生物、病毒和支原体等的污染，即使无血清贴壁培养也只适用于试验研究，不适用于大规模培养，不能满足病毒疫苗等实际生产需要。

无血清培养技术是阐明细胞生成、增殖、分化以及基因表达调控的基础问题的有效工具。与传统培养基相比，无血清培养基组成成分相对清楚，制备过程简单，在现代生物技术学领域得到广泛应用。近年来，对无血清培养基的研究已取得了一些长足的进展：Taub等人开发出了MediumK-1无血清培养基，以SF-DMEM/F12（1:1）为基础培养基，添加多种激素和抗生素，其能支持贴壁MDCK细胞生长，每天增殖1.5倍。美国Sigma-Aldrich公司开发了无血清培养基MDCK-LP和MDCK-LPM，它们适于MDCK细胞的贴壁生长和乙肝病毒疫苗的生产。英国应用微生物研究中心用Gibco无血清商业培养基EpiSerf培养MDCK细胞生产流感病毒疫苗，其病毒滴度为1.0×10⁹病毒空斑形成单位/毫升。然而，诸如上述国外推出的支持MDCK细胞生长的商业培养基成分不明，价格昂贵，不便于大规模使用。目前国内适于MDCK细胞扩大化全悬浮培养的无血清培养基研究不多，因此有必要开发克服现有MDCK细胞培养基缺点、适用于大规模生产的MDCK细胞系悬浮培养的无血清培养基，建立针对MDCK细胞的优化的无血清悬浮培养工艺。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的之一在于提供一种用于培养MDCK细胞系的培养基，特别是用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基，该培养基能支持MDCK细胞悬浮培养，促进MDCK细胞生长，而且安全性好，培养的MDCK细胞系可应用于禽流感疫苗的生产中。本发明的另一目的在于提供一种用于培养MDCK细胞系的培养基的制备方法。

为实现本发明的上述目的，采用如下技术方案：一种用于培养MDCK细胞系的培养基，其特征在于，各组分的浓度以mg/L计为：

基础代谢营养物类：所述基础代谢营养物类为丝氨酸5-55、盐酸精氨酸20-250、亮氨酸20-55、异亮氨酸20-55、酪氨酸20-55、丙氨酸2-10、天冬酰胺2-25、天冬氨酸2-25、盐酸半胱氨酸5-55、谷氨酸2-50、组氨酸5-55、赖氨酸20-250、苯丙氨酸10-55、苏氨酸5-55、色氨酸5-25、缬氨酸20-250；

核苷酸类：所述核苷酸类为次黄嘌呤2-20、胸苷2-5、腺苷2-5、尿苷2-5；