[发明专利]一种鱼类高脂存储肝细胞分离和培养方法

说明书

本发明公开了一种鱼类高脂存储肝细胞分离和培养方法。a、选取45‑55d虾虎鱼幼鱼，在无菌条件下获得其肝脏组织，将肝脏组织分散成块，获得组织块；b、将孔径20μm的细胞筛置于胰蛋白酶终止液中，在孔径20μm的细胞筛上方设置有孔径50μm的细胞筛；c、将组织块置于孔径50μm的细胞筛中，持续添加胰蛋白酶液于孔径50μm的细胞筛中消化组织块，流动持续消化，收集位于孔径20μm的细胞筛上的细胞，用10％FBS清洗，获得高脂存储肝细胞；d、将高脂存储肝细胞接种到培养基中培养。本发明的高脂存储肝细胞能贴壁后稳定一周，脂肪细胞可存活1个月左右，期间可用于细胞水平的实验，从而解决鱼类成熟脂肪细胞分离和培养困难的问题。

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，更具体地涉及一种鱼类高脂存储肝细胞分离和培养方法。

背景技术

在科学研究中，为了进一步验证实验结果的准确性和真实性，一般需要进行细胞水平的验证实验，而在细胞水平使用的细胞来源一是商品化的细胞，二是原代细胞培养。原代细胞培养是从供体活组织中取得细胞后在体外进行的首次培养，使其在人工条件下不断生长和繁殖。此时的细胞保持原有细胞的基本性质，是各类实验研究的基础，是建立各种细胞系的第一步。原代细胞培养又包括可分化的原代干细胞培养和原代成熟细胞培养；体外培养细胞的关键是如何分离得到形态完整、体外代谢活性高的细胞。近年来，许多学者在如何获得活性高且稳定的细胞上做了大量的探索，即细胞分离技术，包括剪切消化法(Anderson,N.G.(1953).Science)，离体胶原酶灌流法(Berry,M.N.,Friend,D.S.(1969).The Journal ofcell biology)，原位胶原酶灌注法(Seglen,P.O.(1976).AcademicPress.)。到目前为止，用于细胞培养的方法主要有以下几种：组织块贴壁培养法(吴宁,吴承龙.(2007))、混合培养法(Bhatia,S.N.,Balis,U.J.,(1999).The FASEBjournal)、单层胶原培养法、共培养体系等，上述常用的原代成熟细胞培养仅能在1-2周内维持细胞的形态与功能后，便逐渐退化死亡，从而使原代成熟细胞培养的应用受到限制。对于肝脏成熟脂肪细胞的分离和培养方法更是鲜有报道，一般的细胞培养选择的基本是原代干细胞进行培养，然后进行分化诱导形成肝脂肪细胞，再进行实验验证，这种常规方法基本可以满足实验需求，但是也存在原代细胞分离培养困难和造模时间长等问题，对于鱼类肝细胞的原代培养更是如此，有鉴于此，提出本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够获取虾虎鱼的高脂存储肝细胞的鱼类高脂存储肝细胞分离和培养方法。

本发明的鱼类高脂存储肝细胞分离和培养方法，包括以下步骤：

a、选取45-55d虾虎鱼幼鱼，在无菌条件下获得其肝脏组织，将肝脏组织分散成块，获得组织块；

b、将孔径20μm的细胞筛置于胰蛋白酶终止液中，在孔径20μm的细胞筛上方设置有孔径50μm的细胞筛；

c、将组织块置于孔径50μm的细胞筛中，持续添加胰蛋白酶液于孔径50μm的细胞筛中消化组织块，流动持续消化，收集位于孔径20μm的细胞筛上的细胞，用含有10％FBS的M199培养基清洗，获得高脂存储肝细胞；

d、将高脂存储肝细胞接种到无血清M199培养基(Gibco.Lot:2044485)中，于27±1℃，5％CO₂条件下培养。隔天更换培养液。细胞贴壁后稳定培养一周，脂肪细胞可存活1个月左右，期间可用于细胞水平的实验。

所述的将肝脏组织分散成块，获得组织块，组织块大小为1±0.1mm²小块。

所述的胰蛋白酶终止液是含有体积分数10％FBS的M199培养基(FBS，Gibco，Lot:2036224C)。

所述的胰蛋白酶液是含质量分数0.25％的胰蛋白酶液。