[发明专利]一种重组犬细小病毒单克隆抗体生产方法

说明书

本发明涉及细胞重组抗体技术领域，具体涉及一种SP2/0细胞灌注用培养基及重组犬细小病毒单克隆抗体生产方法，包括培养基配制、瘤细胞驯化、流加培养和抗体纯化；其中的培养器包括反应罐、补充罐和控制器；由于在批次补料的过程中，流加的培养基成分未能完全补充至重组瘤细胞增殖消耗的区域，削弱了流加培养基中营养成分的补充作用，进而影响到重组瘤细胞的增殖效果；故此，本发明通过设置在反应罐内壁上环绕的凹槽，使补充罐中转动摇匀的培养基成分，在额外的动能作用下沿反应罐的内壁冲刷到重组瘤细胞的培养基中，使流加补充的培养基均衡分布在重组瘤细胞间，从而提升了重组犬细小病毒单克隆抗体生产方法的应用效果。

技术领域

本发明涉及细胞重组抗体技术领域，具体涉及一种重组犬细小病毒单克隆抗体生产方法。

背景技术

随着人们日常生活中工作犬和宠物犬的大幅增加，犬类的生命健康逐渐受到关注，而其中犬细小病毒是危害犬类的最主要的烈性传染病之一，在临床上主要通过高免血清和单克隆抗体进行治疗；在体外环境中培养犬细小病毒的单克隆抗体成为了临床诊疗的有效手段；SP2/0细胞即为骨髓瘤细胞，其体外无限增殖的特性被用于重组抗体的培养，而体外培养的单克隆抗体表达量处于较低水平，阻碍了犬细小病毒单克隆抗体治疗的推广；关于骨髓瘤细胞重组单克隆抗体的介绍，可参见：黄亚杰等,混合培养基模式培养杂交瘤细胞表达单克隆抗体[J],生物学杂志,2016(No.6),104-109。

为提高体外培养中单克隆抗体的表达量，重组骨髓瘤细胞的培养基优化与培养工艺设计成为关键；出现的无血清培养基中添加几十种成分来满足瘤细胞的增殖，来避免血清成分在瘤细胞增殖中带来肉毒素的风险，以及后续分离纯化的困难，但其繁琐的优化设计带来的单克隆抗体表达量提升有限，同时增加了灌注用培养基持续补充的难度。

现有技术中也出现了一些关于SP2/0细胞灌注用培养基及重组单克隆抗体生产方法的技术方案，如申请号为2009100664783的一项中国专利公开了一种制备单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆用培养基及其制备方法，按常规方法配制RPMI-1640完全培养基，然后分别与一定比例的BHK-21、CRFK、Hela等细胞的无细胞培养上清混合，完全培养基与每种细胞上清的体积比为7:1-1:1；该技术方案所提供的杂交瘤细胞克隆用培养基，可完全省略在常规杂交瘤细胞克隆过程中以BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞的环节，大大简化了克隆操作，并使被克隆细胞的生长速度明显提高；但是该技术方案中未解决在杂交瘤细胞的增殖过程中，批次灌注的培养基在杂交瘤细胞间的分布不均衡问题，降低了其中瘤细胞的存活率，进而削弱了瘤细胞中单克隆抗体的有效表达量。

鉴于此，为了克服上述技术问题，本公司设计研发了一种重组犬细小病毒单克隆抗体生产方法，采用了特殊的SP2/0细胞灌注用培养基及重组犬细小病毒单克隆抗体生产方法，解决了上述技术问题。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明提出了一种重组犬细小病毒单克隆抗体生产方法，通过设置在反应罐中切向连通的补料管，与其内壁上环绕的凹槽相配合，使补充罐中转动摇匀的培养基成分，在额外的动能作用下沿反应罐的内壁冲刷到重组瘤细胞的培养基中，使得流加补充的培养基均衡分布在重组瘤细胞间，从而提升了重组犬细小病毒单克隆抗体生产方法的应用效果。

本发明所述的一种重组犬细小病毒单克隆抗体生产方法，该方法步骤如下：

S1、培养基配制：选择重组瘤细胞型培养基作为主成分，并准备Tris-HCL缓冲液、乙酸和10％血清浓度的胎牛血清，控制培养基处于pH5.2-6.4的弱酸性状态下；通过设置的缓冲液将培养基的调节为弱酸性的状态，抑制了血清中含有的影响因子活性，且延长了培养基的保质时间；