[发明专利]一种非洲猪瘟病毒荧光PCR快速检测试剂盒

权利要求书

1.一种非洲猪瘟病毒荧光PCR快速检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒由引物、探针、ROX校正染料、消化液、DNA结合液、DNA洗涤液、DNA洗脱液、蛋白酶K、无菌无核酸酶水、PCR扩增反应液、阴性对照、阳性对照、DNA吸附柱和收集管及说明书组成；

非洲猪瘟病毒的荧光PCR快速检测方法包括以下步骤：

S1：选取病死或扑杀猪的脾脏、淋巴结或肾脏等病变部与健康部交界处组织，待检活猪，用注射器取血至少2mL，2～8℃保存并送实验室检测，其中要求送检病料新鲜，严禁反复冻融病料；

S2：对选取的样品进行处理，以每份组织分别从三个不同的位置称取样品约1g，用手术剪剪碎混匀后取0.05g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理盐水继续研磨，待匀浆后转至1.5mL灭菌离心管中，以8000rpm的转速离心2min即得样品组织研磨液；

S3：选取多个PCR管(2),每管加入20μL核酸释放液，再分别加入阴性对照、阳性对照，然后将S2中制得的样品组织研磨液上清或血清5μL加入至PCR管(2)内，然后将多个PCR管(2)安装在试剂盒上涡旋混匀后瞬时离心，然后将PCR管(2)放入PCR仪上以80℃温育2min，瞬时离心后上清可直接作为模板进行检测；所述的试剂盒用于解决对多个PCR管内的试液进行离心时，由于多个PCR管的离心不是同时进行的，导致离心后的试液会再次发生扩散，从而影响试液检测的问题；

S4：实时荧光RCR操作：设被检样品、阴性对照和阳性对照总和为N，则反应体系配制如下：

试剂：体系，无菌无核酸酶水6.3×(N+1)μL、PCR反应液10×(N+1)μL、荧光探针1.7×(N+1)μL，将以上配制的反应体系充分混匀后，分装每个反应管中各18μL，分别取2μL模板DNA，加入相应反应管中，混匀并作好标记，在荧光PCR扩增仪上进行以下反应：95℃2min，循环95℃5s，60℃15s，共40次，每次循环的第二步60℃15s时，收集荧光信号。

2.根据权利要求1所述的一种非洲猪瘟病毒荧光PCR快速检测试剂盒，其特征在于：引物、探针使用时用无菌无核酸酶水稀释至保存浓度100pmol/μL，工作浓度10pmol/μL；所述探针标记为5′FAM--3′BHQ-1，5′，3′端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团。

3.根据权利要求1所述的一种非洲猪瘟病毒荧光PCR快速检测试剂盒，其特征在于：其中，

荧光混合液的制备：上下游引物、探针各10pmol/μL，ROX校正染料以10:10:5:1的比例混匀，定量分装，ROX购买商品化试剂；

蛋白酶K的制备：将蛋白酶K干粉用无菌无核酸酶水溶解至浓度20mg/mL；

阴对对照：购买的无菌无核酸酶水；

PCR反应液：购买的商品化试剂，含有TaqDNA热启动酶、dNTPs、MgCl₂等成分；

阳性对照：阳性对照生产用线性化质粒，用重组细菌种子接种平培养基培养，提取质粒，酶切，胶回收；

吸附柱收集管为购买，吸附柱装量为800μL/个，离心柱层析膜为硅基质膜，厚度为0.28cm，收集管的装量为2mL/个。