[发明专利]利用原核转录系统制备重组真核mRNA的方法及其应用

权利要求书

1.利用原核转录系统制备重组真核mRNA的方法。

2.如权利要求1所述的利用原核转录系统制备重组真核mRNA的方法，其特征在于，所述方法的步骤包括：1)表达用于重组真核mRNA转录与加帽过程所需的酶系统，获得原核体外转录-加帽酶系统→2)制备线性化转录模板DNA→3)重组真核mRNA的转录、加帽与纯化。

3.根据权利要求2所述的利用原核转录系统制备重组真核mRNA的方法，其特征在于，所制备的重组真核mRNA分子具备真核生物在蛋白翻译过程中所需的所有mRNA特征，能够进一步被真核翻译系统所识别并利用。

4.根据权利要求2所述的利用原核转录系统制备重组真核mRNA的方法，其特征在于，所述步骤1)是，在原核细胞体内同时表达转录重组mRNA所需的RNA聚合酶和mRNA 5′端加帽所需的酶系统，表达后的原核细胞经裂解，制得含有重组RNA聚合酶和加帽酶的细胞裂解物，即原核体外转录-加帽酶系统。

5.根据权利要求2所述的利用原核转录系统制备重组真核mRNA的方法，其特征在于，所述步骤2)包括：重组mRNA转录模板质粒的设计→将重组目的mRNA对应的DNA序列克隆至转录模板质粒的多克隆位点处，得到重组mRNA转录模板质粒→将重组mRNA转录模板质粒线性化，得到线性化转录模板DNA。

6.根据权利要求2所述的利用原核转录系统制备重组真核mRNA的方法，其特征在于，所述步骤3)是，将步骤1)所制得的原核体外转录-加帽酶系统和步骤2)所制得的线性化DNA模板混合后反应，在体外条件下反应合成制备出重组目的mRNA分子，再将重组目的mRNA纯化。

7.根据权利要求4所述的利用原核转录系统制备重组真核mRNA的方法，其特征在于，所述重组mRNA所需的RNA聚合酶为单亚基的RNA聚合酶。

8.根据权利要求7所述的利用原核转录系统制备重组真核mRNA的方法，其特征在于，所述重组mRNA所需的单亚基RNA聚合酶至少包括T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶、K11 RNA聚合酶或N4 RNA聚合酶。

9.根据权利要求8所述的利用原核转录系统制备重组真核mRNA的方法，其特征在于，所述重组mRNA所需的RNA聚合酶采用T7 RNA聚合酶。

10.根据权利要求4所述的利用原核转录系统制备重组真核mRNA的方法，其特征在于，所述mRNA 5′端加帽所需的酶系统是任意能够将mRNA的5′端修饰成“帽子”结构或类似“帽子”结构的酶或酶系统。

11.根据权利要求10所述的利用原核转录系统制备重组真核mRNA的方法，其特征在于，所述mRNA 5′端加帽所需的酶系统采用牛痘病毒的mRNA加帽酶系统。

12.根据权利要求5所述的利用原核转录系统制备重组真核mRNA的方法，其特征在于，所述重组mRNA转录模板DNA采用线性化的质粒；所述重组mRNA转录模板质粒含有一个融合了原核转录元件和真核翻译元件的杂合表达框，其至少包括以下特征：起始重组mRNA转录的原核启动子、提高真核生物翻译效率以及mRNA稳定性的5′UTR序列、可以直接通过酶切-连接的形式将目的mRNA对应的DNA序列插入基因表达框中的多克隆位点、提高真核生物翻译效率以及mRNA稳定性的3′UTR序列、包括30-200个连续的腺苷酸的多聚腺苷酸序列以及紧随其后的质粒线性化位点。

13.根据权利要求12所述的利用原核转录系统制备重组真核mRNA的方法，其特征在于，所述多克隆位点的序列为：5′-ATGGGTACCGTCGACTCTAGACTCGAGGGATCCGAATTCAGCTAGCCTTAA-3′。