[发明专利]利用原核转录系统制备重组真核mRNA的方法及其应用

说明书

本发明提供了一种利用原核转录系统制备重组真核mRNA分子的方法，所述方法的步骤包括：1)表达用于重组真核mRNA转录与加帽过程的所需的酶系统，获得原核体外转录‑加帽酶系统→2)制备线性化转录模板DNA→3)重组mRNA的转录、加帽与纯化。本发明所制备的重组mRNA分子具备真核生物在蛋白翻译过程中所需的所有mRNA特征，因此能够进一步被真核翻译系统所识别并利用。本发明克服了目前重组mRNA领域的缺陷，能够过程简单、成本低廉地生产遗传特征稳定、无载体阻碍效应的重组真核mRNA，满足大规模地工业化生产需求。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，本发明涉及利用原核转录系统制备重组真核mRNA分子。

背景技术

基因的表达是指细胞在生命过程中，把储存在DNA序列中遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子的过程。其包括两个阶段：基因的转录和基因的翻译。基因的转录指的是以DNA的一条链为模板，按照碱基互补配对原则，合成信使RNA(mRNA)的过程。基因的翻译指的是mRNA根据三联体密码，按照其序列顺序合成对应的氨基酸序列的过程。由此可见，mRNA在遗传信息流中起着中间体的作用。和DNA、蛋白质一样，mRNA也有着被开发成生物制品的潜力。

相对于DNA和蛋白质，mRNA有着不稳定的特质，重组mRNA技术也没有重组DNA和重组蛋白质技术那么成熟。因此，长期以来，mRNA在实际中没有得到广泛的应用。但是正是由于mRNA在生物体内环境下半衰期短的特点，使得mRNA的生物制品相对于DNA和蛋白质的生物制品有着更高的安全性。最近十年，mRNA的生物制品越来越受到研究者的关注，其在疫苗和药物开发中的应用已证实其有着极具吸引力的优势。

目前重组mRNA技术大致可以分为两类，一类是基于重组RNA病毒载体(比如：甲病毒)，能够使得目的mRNA实现自我复制的技术。但这类技术如果用于疫苗或药物的生产则容易出现以下的缺点。首先，由于RNA聚合酶本身的严谨性较差，RNA病毒基因组在自身复制过程中容易发生突变，使得目的mRNA也有随之发生变异的可能。其次，重组RNA病毒载体在注射到动物体内后有可能引发动物的免疫反应，从而产生载体阻碍效应，使得疫苗或药物的效果大打折扣。另外一类技术是基于体外转录(比如：RNActive技术)。该技术利用线性化的DNA模板，使用体外转录酶反应，从而大量生产mRNA。该技术需要分别使用多步酶反应来完成mRNA的生产，包括DNA模板的线性化、mRNA的转录、5`端加帽和3`端加尾等步骤。因此，容易造成mRNA的不稳定以及生产成本升高。

重组mRNA技术的开发的难度主要在以下几点：1.mRNA的不稳定性。能够分解mRNA的RNA水解酶种类繁多并且量大，在环境中几乎无处不在。大量转录重组mRNA时，其在体外极有可能被RNA酶水解，从而影响mRNA的产量。因此设计合理的生产工艺流程对减少mRNA的损失至关重要。2.原核生物与真核生物在转录和翻译过程中使用不同的机制。诸多原核生物，比如大肠杆菌，常常被用来当做工业化生产重组DNA和重组蛋白质的重要平台，其有着生长快速、成本低以及遗传操作简单等优点。但当使用大肠杆菌来生产重组mRNA时，则需要克服原核生物和真核生物在转录和翻译过程中的不同机制所造成的兼容问题，例如：原核生物产生的mRNA不含有5′端“帽子”结构和3′端Poly(A)序列，而5′端“帽子”结构和3′端Poly(A)序列对mRNA在真核细胞内的稳定性以及后续的翻译过程至关重要。3.目的mRNA的纯化。无论是真核生物还是原核生物在生命活动过程中都需要转录产生各种RNA，包括mRNA、tRNA以及rRNA等。mRNA只占RNA总量的3-5％，而mRNA又是上千种不同基因转录产物的总和。如何提高目的mRNA的含量，以及将目的mRNA从总RNA中纯化出，都存在一定的难度。

目前缺乏适合工业化大生产的重组mRNA制备技术。建立一个操作简单、成本低廉以及生产稳定的重组mRNA制备技术将对mRNA疫苗和药物的开发以及生产带来极大的便利。

发明内容