[发明专利]一种人脐带来源的间充质干细胞及其制备方法

权利要求书

1.一种人脐带来源的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，它是采用以下工艺方法制备：从保存液取出脐带后，用75%的乙醇消毒也浸泡5min消毒，使用含双抗的PBS清洗三次，剪断双侧结扎部分，去除脐带血管内淤血，将脐带浸入含双抗的PBS中，用PBS反复冲洗脐带和脐静脉内腔3次，剔除血管，暴露华通胶，然后将脐带剪成1-3mm₃大小的组织块后放入50ml离心管中，加入质量体积百分比浓度为0.1％的消化液，置于37℃恒温震荡仪内持续消化4～10h，100目筛网过滤，离心收集细胞；加入PBS液冲洗细胞3次，用间充质干细胞培养基溶液重悬细胞，调整细胞密度5×10³～1×10⁴/cm₂，接种于T-175培养瓶中，37℃、5％CO₂培养箱中培养，24h后更换培养基，以后每隔3天更换培养基一次，待细胞达到80％融合时，传代培养或冻存备用。

2.根据权利要求1所述的一种人脐带来源的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，制备的间充质干细胞为脐带华通胶、脐带血管周围、脐血和脐静脉血管内皮下的任何一种来源或全部。

3.根据权利要求1所述的一种人脐带来源的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述脐带采用足月健康胎儿脐带，并且采集之前产妇已接收艾滋病病毒抗体、乙型肝炎病毒抗体、丙型肝炎病毒抗体、梅毒螺旋体抗体、谷丙转氨酶、支原体检测，并全部检测结果为阴性。

4.根据权利要求1所述的一种人脐带来源的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，采集后的脐带置于4℃保存，并于6h之内分离脐带。

5.根据权利要求1所述的一种人脐带来源的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述消化液中加入II型胶原酶和胰酶混合液。

6.根据权利要求1所述的一种人脐带来源的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，消化脐带组织块的时间为6h。

7.根据权利要求1所述的一种人脐带来源的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞培养基为含有25mmol/L谷氨酰胺与2%UltroserG的Ultraculture SFMedium培养基。

8.如权利要求1～7任一项所述方法制备的间充质干细胞，其特征在于，在免疫学表型鉴定中，具有以下技术特征：

①在标准培养条件下在塑料制细胞培养瓶中贴壁生长；

②表达粘附分子受体标记物CD29/CD44，间质细胞标记CD73(SH3)/CD105(SH2)，及干细胞标记物CD90，而低表达或不表达内皮细胞标记物CD31、造血干细胞标志CD34和组织相容性II类抗原HLA-DR；

③体外诱导分化为成骨细胞、软骨细胞与脂肪细胞。