[发明专利]一种人脐带来源的间充质干细胞及其制备方法

说明书

本发明公开了一种人脐带来源的间充质干细胞的制备方法，它是采用足月健康胎儿的脐带经过无菌处理，机械剪切，暴露华通胶，经过胶原酶消化后分离培养而成，经冻存复苏后细胞活力无明显下降，是临床使用的理想细胞来源。本发明还涉及经上述方法制备的间充质干细胞，按照国际干细胞研究协会(ISSCR)制定的间充质干细胞的标准进行形态学、免疫表型以及体外分化实验鉴定确认为间充质干细胞。其细胞数量、细胞活力、纯度及其倍增时间、增殖能力均明显高于骨髓来源的间充质干细胞。

技术领域

本发明涉及原始间充质干细胞的制备方法，尤其涉及以人脐带华通胶为材料制备人脐带来源的间充质干细胞的制备方法。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal stem cell，MSC)间充质干细胞是来源于中胚层的成体干细胞，广泛存在于全身结缔组织和器官间质中，是一类具有多向分化潜能的组织干细胞。目前已经进行的临床试验研究证实，具有自我更新、多向分化潜能的间充质干细胞可以应用于多种疾病的治疗和康复。但是，所有的研究或治疗方案都必须建立在获得足量间充质干细胞的基础上，快速有效的分离间充质干细胞作为种子细胞具有非常重要的研究价值和经济利益。MSC可从成体骨髓、脂肪、牙髓、外周血等多种组织获得，也可从胎儿的脐带、胎盘、脐血等组织获得。脂肪、牙髓与骨髓源性MSC存在高度病毒污染的可能，且随着年龄增长其细胞数量和扩增、分化能力出现明显下降趋势，还会增加手术痛苦，并且成体间充质干细胞仅限于自体使用。其他方法如从脐血和外周血中培养MSC具有一定难度，且MSC在足月分娩的脐血或动员的外周血中数量尚存在争议。脐带间充质干细胞来源充足、病毒污染概率低、免疫源性弱、细胞更为原始，也不存在社会、伦理和法律方面的争议，从脐带中分离培养MSC是获得高质量、足够数量MSC的最有效方法，并进行形态学、分化功能和表面标志物等生物学表型鉴定其各种特征。脐带是连于胚胎脐部与胎盘问的索状结构，外被羊膜、内含分化的粘液性结缔组织，结缔组织内除闭锁的卵黄囊和尿囊外，还有脐动脉和脐静脉。脐带中的MSC来源分为四种：①来源于华通胶(Wharton’sjelly，WJ)，它是包裹血管周围的粘蛋白样组织，距血管外周大约3mm，富含透明质酸和葡萄糖胺聚糖，形成了成纤维细胞周围的水凝胶结构；②来源于脐血管周围；③来源于脐血；④来源于脐静脉血管内皮下。

目前对于脐带间充质干细胞分离的方法主要有贴壁法和酶消化法两种。其中贴壁法操作简便，对实验条件要求低，容易掌握。这种方法的缺点在于，获得原代细胞的周期长，液体的浮力使组织块漂起，使其丧失了长出细胞的能力，减少了细胞数量，此外，产物中混有部分内皮细胞，需要通过后期的酶消化处理进行进一步的筛选。采用胶原酶消化法可在短时间内获得细胞，且杂细胞少，且操作方便，其中胶原酶消化法多以胶原酶II为主。

人脐带MSC在适当的诱导条件下能向多种组织细胞分化，是理想的组织工程种子细胞。MSC诱导植入有望成为较广泛的细胞治疗于段。研究表明MSC能够植入关节损伤部位可向软骨细胞分化，也能够降低宿主抗移植物的排异反应促进造血干细胞的移植效果；MSC还可应用于神经退行性疾病治疗，在临床研究中取得了不错的效果；也可能成为未来基因缺失的基因治疗载体细胞。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种容易获得大量MSC的原材料，细胞倍增时间短的人脐带间充质干细胞的制备方法，按本发明方法制备的间充质干细胞具有更强的免疫调节、自我更新及多向分化潜能，而且冻存复数后其活率不会明显的降低。