[发明专利]唐菖蒲伯克霍尔德氏菌荧光定量PCR内参基因及其引物的筛选和应用

说明书

本发明公开了唐菖蒲伯克霍尔德氏菌实时荧光定量PCR（qRT‑PCR）内参基因及其引物的筛选和应用。根据已获得的转录组分析结果及已报道的内参基因，初步筛选表达相对较为稳定的12个候选内参基因，基因名分别为：atpD、clpP、clpX、ftsZ、gyrB、lpxC、pyrG、recA、rpoB、rpoD、thyA和16S；针对上述候选基因，设计扩增引物，对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌不同培养条件下（温度、培养基初始pH值、培养时间、不同浓度NaCl处理）的内参基因进行筛选，采用geNorm、NormFinder和Bestkeeper软件对qRT‑PCR结果进行分析，最终筛选到在不同培养条件和NaCl处理条件下最稳定表达的内参基因。本发明有利于不同条件下唐菖蒲伯克霍尔德氏菌基因表达分析研究的稳定性和可靠性。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及唐菖蒲伯克霍尔德氏菌实时荧光定量PCR内参基因及其引物的筛选与应用。

背景技术

伯克霍尔德氏菌(Burkholderia)是一种革兰氏阴性棒状细菌，广泛存在于水、土壤、植物体和人体等环境中。伯克霍尔德氏菌在农业上可作生物降解、生防及促进植物生长之用。部分伯克霍尔德氏菌可合成小分子抗菌物质——毒黄素，毒黄素具有良好的肿瘤细胞抑制活性和抗真菌活性(特别是对唑类药物耐药烟曲霉的抑制活性)，是一种具有良好应用前景的化合物，在进行结构修饰后可作为候选药物应用。唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)HDXY-02具有高产毒黄素的特性，作为生物合成毒黄素的生产菌株具有重要的现实意义。研究过程中发现B.gladioli HDXY-02和另一株购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection,CICC)的B.gladioli CICC 10574的毒黄素合成能力具有显著差异，B.gladioli CICC 10574几乎不产毒黄素。转录组测序发现两株菌毒黄素合成相关基因的表达量存在显著差异，但是需要进行进一步的验证。

实时荧光定量PCR(qRT-PCR)具有操作简单，成本较低，灵敏度高的优势，经常被用于目的基因的转录水平研究和转录组数据的验证。qRT-PCR实验需要表达稳定的管家基因作为内参。但是，在不同的实验条件下，内参基因RNA表达水平并不稳定，仅根据文献中常用的内参基因进行基因表达水平分析可能会使实验结果产生偏差。在进行基因的表达量分析时，需要根据各自研究的需要来选择合适的内参基因。因此，从多种内参基因中筛选出B.gladioli HDXY-02与B.gladioli CICC 10574中稳定表达的内参基因十分必要。内参基因的确定对于准确分析B.gladioli不同菌株中基因的表达差异研究十分关键。本发明对B.gladioli HDXY-02和B.gladioli CICC 10574的内参基因进行了筛选，旨在找到B.gladioli HDXY-02和B.gladioli CICC 10574中最稳定的内参基因，为后续不同B.gladioli菌株的基因表达分析及转录调控机制研究奠定基础，为进一步提高B.gladioliHDXY-02的毒黄素产量提供依据。

发明内容

本发明的目的在于提供不同培养条件和不同浓度NaCl处理下，B.gladioli菌株实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的内参基因及其引物。