[发明专利]大鳞副泥鳅精液超低温冷冻保存方法

说明书

本发明公开了大鳞副泥鳅精液超低温冷冻保存方法，包括以下步骤：步骤一、将NaCl、KCl、CaCl₂·2H₂O、MgCl₂·6H₂O、NaHCO₃按照浓度比依次为80:50:5:2:50进行混合，配置成稀释液，置于4℃保存，备用；步骤二、将大鳞副泥鳅精液与稀释液按照体积比为1:2～4进行混合，再加入体积分数为7.5％～12.5％的DMSO混匀，得到精液抗冻混合液，并分装于冻存管中；步骤三、将步骤二的冻存管先在液氮面上方6cm处平衡10min，接着在液氮面上平衡5min，最后投入液氮中冷冻保存。本发明使得精子活力，精子的寿命，细胞膜的完整率都得到提高，成为有效、持久的保存方法。

技术领域

本发明涉及精液超低温冷冻保存技术领域，具体是一种大鳞副泥鳅精液超低温冷冻保存方法。

背景技术

大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)属鲤形目鳅科花鳅亚科副泥鳅属，自然分布于长江、嘉陵江和岷江水系、辽河中下游、黄河及黑龙江地区，其肉质鲜美，维生素和不饱合脂肪酸含量丰富，中医记载具有补血益气、壮阳利尿的功能，已成为我国重要的淡水养殖品种。随着大鳞副泥鳅养殖规模和苗种需求日益扩大，人工育苗才能满足苗种的养殖需求。然而，人工育苗多为近亲交配，易产生种质退化、遗传多样性下降和抗病抗逆性能降低等问题，严重影响大鳞副泥鳅养殖业的可持续健康发展。

不同鱼类的精液超低温冷冻保存方法是存在差异的。作为重要的经济养殖鱼类，大鳞副泥鳅精液常温(20～24℃)和超低温冷冻(-196℃)保存都进行过研究，常温状态下，保存时间较短，至多保存132h；在超低温冷冻中，虽保存时间延长，由于未进行多种方案探讨，无法确定是否还有最佳方案。且现有的保存方法，对于大鳞副泥鳅的精子的活力、精子的寿命、细胞膜的完整率均很低，不利于有效、持久的保存。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种大鳞副泥鳅精液超低温冷冻保存方法，其使得精子活力，精子的寿命，细胞膜的完整率都得到提高，成为有效、持久的保存方法。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种大鳞副泥鳅精液超低温冷冻保存方法，包括以下步骤：

步骤一、将NaCl、KCl、CaCl₂·2H₂O、MgCl₂·6H₂O、NaHCO₃按照浓度比依次为80:50:5:2:50进行混合，配置成稀释液，置于4℃保存，备用；

步骤二、将大鳞副泥鳅精液与稀释液按照体积比为1:2～4进行混合，再加入体积分数为7.5％～12.5％的DMSO混匀，得到精液抗冻混合液，并分装于冻存管中；

步骤三、将步骤二的冻存管先在液氮面上方6cm处平衡10min，接着在液氮面上平衡5min，最后投入液氮中冷冻保存。

优选的是，还包括：

步骤四、将精液抗冻混合液从液氮中取出，于液氮口处平衡5min后，再于37℃水浴中解冻直至融化。

优选的是，步骤二中大鳞副泥鳅精液与稀释液的体积比为1:3，DMSO的体积分数为10％。

优选的是，步骤二中大鳞副泥鳅精液通过以下方式采集：使用MS-222溶液对大鳞副泥鳅雄鱼进行麻醉处理，用毛巾擦干鱼体水分，挤压腹部采集精液。