[发明专利]一种诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜上皮细胞的培养方法及应用

权利要求书

1.一种诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜上皮细胞的培养方法，所述人胚胎干细胞为商业化人胚胎干细胞株系，其特征在于，包括以下步骤：

S1，将人胚胎干细胞复苏后在E8培养基中培养4-6天，接种于低吸附培养皿中，使用NP培养基分化培养6-10天后获得神经干细胞；所述低吸附培养皿为Vitronectin包被的培养皿；所述NP培养基的制备方法为在基础培养基DMEM/F12中添加18-22wt%血清替代物KSR、0.5-1.5wt%丙酮酸钠、0.5-1.5wt%非必需氨基酸、0.5-1.5wt%谷氨酰胺、8-12nM 的ROCK抑制剂Y27632和0.5-1.5v/v%双抗青霉素/链霉素；

S2，将步骤S1得到的神经干细胞消化，接种于贴附培养皿，使用上皮分化培养基继续分化4-7天；所述上皮分化培养基的制备方法为SHEM培养基与D-KSFM培养基按照体积比1：1.5-2.5混合后，再添加0.5-1.5wt%丙酮酸钠、0.5-1.5wt%非必需氨基酸、0.5-1.5wt%谷氨酰胺和8-12nM的ROCK抑制剂Y27632；所述SHEM培养基的制备方法为基础培养基DMEM/F12中添加4-6v/v%血清FBS、0.4-0.6mg/ml的氢化可的松、4-6ml/L的ITS 、0.4-0.6v/v%DMSO、8-12ng/ml人上皮细胞生长因子EGF 和0.5-1.5v/v%双抗青霉素/链霉素；

S3，将步骤S2得到的细胞消化后，加入小鼠成纤维细胞系3T3细胞或接种于去上皮羊膜表面，再用上皮分化培养基进行混合培养7-14天得角膜上皮细胞。

2.根据权利要求1所述的诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜上皮细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤S1具体包括以下步骤：

S11，将人胚胎干细胞复苏后在E8培养基中培养4-6天后，细胞在10×显微镜下呈一角硬币大小的团块时，弃掉培养基，加入CTS™ TrypLE™ Select Enzyme于37℃消化2.5-3.5分钟；

S12，在显微镜下观察到细胞团块边缘松散发亮后，弃消化液，加入E8培养基；对整个培养皿划线，使细胞成团块状脱落形成细胞团块悬液；

S13，将细胞团块悬液以80-120转/分钟的转速离心4-6分钟；弃上清，用NP培养基重悬混匀，接种于低吸附培养皿，置于5%CO₂、37℃培养箱中培养6-8天，每天换液。

3.根据权利要求1所述的诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜上皮细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤S2具体包括以下步骤：

S21，将步骤S1得到的神经干细胞以700-900转/分钟转速离心8-12分钟，弃上清，加入CTS™ TrypLE™ Select Enzyme于37℃消化4-6分钟，用NP培养基终止消化，轻轻吹打成单个细胞悬液；

S22，再以1400-1600转/分钟的转速离心8-12分钟，弃上清；加入上皮分化培养基重悬，按（2.5-3.5）×10⁴/cm²的接种密度接种至包被好的贴附培养皿中，置于5%CO₂、37℃培养箱中培养4-7天，每天换液。

4.根据权利要求1所述的诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜上皮细胞的培养方法，其特征在于，在步骤S3中，所述小鼠成纤维细胞系3T3细胞的制备和加入方法包括以下步骤：

S31，当小鼠成纤维细胞系3T3细胞生长至70%-80%融合度时，弃上清，加入含8-12μg/mL的丝裂霉素的SHEM培养基，于37℃孵育2.5-3小时后，弃上清，更换新鲜的SHEM 培养基，放入5%CO₂、37℃培养箱备用，隔天使用；

S32，取步骤S31得到的3T3细胞，弃培养基上清，加入0.20-0.30wt% 含EDTA的Trypsin于37℃消化2.5-3.5分钟，当细胞在显微镜下呈圆形时加入上皮分化培养基终止消化，轻轻吹打成单个细胞悬液，以1400-1600转/分钟的转速离心4-6分钟，弃上清，使用上皮分化培养基将细胞调整至（4.5-5.5）× 10⁵ cell/ml备用；

S33，取S32得到的3T3细胞悬液加入到等量的步骤S2得到的细胞的消化后悬液中，混匀，置于5%CO₂、37℃培养箱中培养7-14天，隔天换液。