[发明专利]一种诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜上皮细胞的培养方法及应用

说明书

本发明提供了一种诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜上皮细胞的培养方法，包括以下步骤：S1，将人胚胎干细胞复苏后在E8培养基中培养4‑6天，接种于低吸附培养皿中，使用NP培养基分化培养6‑10天后获得NP细胞；S2，将步骤S1得到的NP细胞消化，接种于贴附培养皿，使用上皮分化培养基继续分化4‑7天；S3，将步骤S2培养的细胞消化后，加入小鼠成纤维细胞系3T3细胞或接种于去上皮羊膜表面，再用上皮分化培养基进行混合培养7‑14天得角膜上皮细胞。

技术领域

本发明涉及一种诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜上皮细胞的培养方法及应用，属于细胞培养技术领域。

背景技术

角膜上皮干细胞（Corneal epithelial stem cell CESC）又被称为角膜缘干细胞（Corneal Limbal stem cells CLSC）或角膜缘祖细胞（Corneal Limbal progenitorcells CLPC），是角膜上皮细胞不断更新替换的唯一来源，起着维持角膜上皮动态平横和保持角膜透明的作用，还起着阻止结膜上皮细胞的“屏障”功能，防止结膜上皮细胞迁移至角膜表面。

角膜缘干细胞缺乏症（Corneal limbal stem cell dysfunction，LSCD）。是因角膜缘干细胞的缺失或异常，进而导致角膜上皮细胞无法再生，使角膜上皮无法维持其行使正常功能的细胞数量的疾病。角膜缘干细胞缺乏容易引起持续性的角膜上皮缺损、慢性炎症、角膜上皮结膜化以及新生血管侵入等，进而引起角膜浑浊、透明度下降，给患者造成严重的视力障碍，严重情况下将导致患者失去视力。

角膜缘干细胞缺乏症的治疗根据角膜缘干细胞的缺损程度的不同会有所不同。对轻度部分角膜缘干细胞缺乏的治疗需要根据患者的个体情况来确定。当患者的眼表上皮仍然完整，视力良好，且无其它症状时可采取保守治疗，给予眼部局部用药润滑，如自体血清等，起预防角膜上皮糜烂的作用。当患者出现部分角膜-角膜缘-结膜上皮缺损时，可通过简单手术将侵入角膜缘的结膜上皮刮除，跟踪观察角膜、结膜的愈合以及角膜缘的“屏障”重建情况。当患者出现部分角膜被结膜上皮覆盖或出现持续性的角膜上皮缺损时，则需要采取手术进行干预。对于重度/全角膜缘干细胞缺乏的患者，则需要进行角膜缘移植手术才可能角膜功能。这些手术的目的是期望通过移除患者病变的角膜上皮或角膜翳之后，移植新的角膜缘干细胞来修复原有被损伤的角膜上皮。

然而，这些技术都或多或少的面临一些无法逾越的难题，如复发/持续性的上皮缺损，新生血管侵入，角膜结膜化，角膜变薄/融化/穿孔，排异反应，细菌感染，供体缺乏，或者引起一些来自供体的潜在疾病的传播等。人们期望可以寻找到其它安全可靠的替代物，如人胚胎干细胞（hESC）等“种子”细胞来诱导分化成角膜缘上皮干细胞，进而成为分化成角膜上皮细胞的可靠细胞来源。

但是，现有技术中并没有成熟的诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜上皮细胞的方法。

发明内容

本发明提供了一种诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜上皮细胞的培养方法及应用，可以有效解决上述问题。

本发明是这样实现的：

一种诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜上皮细胞的培养方法，所述人胚胎干细胞为商业化人胚胎干细胞株系，包括以下步骤：

S1，将人胚胎干细胞复苏后在E8培养基中培养4-6天，接种于低吸附培养皿中，使用NP培养基分化培养6-10天后获得NP细胞；

S2，将步骤S1得到的NP细胞消化，接种于贴附培养皿，使用上皮分化培养基继续分化4-7天；

S3，将步骤S2培养的细胞消化后，加入小鼠成纤维细胞系3T3细胞或接种于去上皮羊膜表面，再用上皮分化培养基进行混合培养7-14天得角膜上皮细胞。