[发明专利]一种用于猫冠状病毒基因扩增引物及基因分型方法

说明书

本发明涉及一种用于猫冠状病毒基因扩增引物及基因分型方法。该引物为猫冠状病毒S基因引物，应用该引物可以建立猫冠状病毒纤突蛋白基因S上一个SNP位点(g.23531A＞Y)的高分辨率溶解曲线(HRM)鉴别方法。应用该引物建立的检测方法可快速地从宠物临床样本中检测并鉴定猫冠状病毒基因组第23531位点的基因型，进而推断相应毒株全身性感染力表型，可作为猫冠状病毒致病力筛查的依据，亦可作为猫传染性腹膜炎临床诊断的重要参考。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种用于猫冠状病毒基因扩增引物及检测与分型方法。

背景技术

猫冠状病毒(Feline coronavirus，FCoV)属于冠状病病毒科，冠状病毒属成员。根据感染猫只的临床症状差异，人们习惯于将FcoV分为猫肠道冠状病毒(Feline entericcoronavirus，FECV)和猫传染性腹膜炎病毒(Feline infectious peritonitis virus，FIPV)。其中由FECV引起的猫肠道感染可能出现脱水，但临床症状轻微，致死率较低。猫传染性腹膜炎(Feline infectious peritonitis，FIP)则是一种免疫介导的慢性、渐进性传染病，以腹膜炎、化脓性肉芽肿性血管炎、大量腹水积聚及高致死率为主要特征。该病主要感染两岁以下幼猫，尤其纯种猫更易感。发病猫可表现为干性(非渗出性)和湿性(渗出性)腹膜炎。本病是威胁猫类健康的最为重要的一种传染性疾病。

FIP病变的确切过程不清楚，目前主要有两个假说。(1)内源性变异假说：病毒在巨噬细胞内发生复制。猫感染没有毒力的猫冠状病毒(Feline coronavirus，FCoV)，病毒在肠道细胞内复制，某些基因片段出现突变，形成不同的表型，使它有能力在细胞内复制。(2)抗体依赖性感染增强假说：任何的猫冠状病毒都可以引发FIP，是否出现FIP与猫的免疫应答机制决定，病毒感染后可产生免疫复合物疾病、抗病毒抗体在体内不能有效地清除病毒，反而通过Fc受体介导的抗体依赖性感染增强作用(ADE)使感染增强，造成免疫系统功能紊乱。两个假说的关键病理核心过程都是病毒在巨噬细胞内复制。如果早期没有将感染的巨噬细胞清除掉，身体将出现致命的III型变态反应，即为传染性腹膜炎。

基于以上原因，FIP临床上的生前诊断(ante-mortem diagnosis)一直是本病诊断的难点，原因在于目前FIP致病性病原FIPV与FCoV难以区分。在猫群中，FCoV的抗体阳性率可达到36-75％，而FIP只占FCoV感染猫的5-10％，也就是说在这些病毒感染阳性者中只有约5％的最后会发生猫传染性腹膜炎。因此，单纯的FCoV抗体阳性及核酸的检出对于FIP的诊断无实际的参考意义。传统的诊断多以综合性诊断为主，在没有渗出性病变的案例中，诊断FIP尤为困难。当有积液存在时，首先需要检测积液，进行排查，这种方法要比检测血液的指标更具有参考性。在没有渗出性案例中，多个流行病学因素需要排查，包括病史、猫的来源、临床症状、实验室数据改变、抗体滴度都应该考虑在内，根据这些信息来决定是否需要做侵入性的进一步确诊。

FIP具有发生率高、诊断困难、难于预防以及很短时间内几乎不可逆死亡等特点，目前还没有有效的长期治疗的方案，建立并推广一种快速准确的诊断方案至关重要。但受诸多因素影响，目前现有的FIP的诊断方法结果可靠性和实际操作性差，因此市场迫切需要一种快速、简便、准确的FIP诊断新产品或新技术。

发明内容

鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供一种猫冠状病毒基因检测与分型引物及HRM扩增方法。采用本发明的引物可以快速地从猫粪便、血浆、血清、腹水等样本提取的RNA中的检测猫冠状病毒核酸，具有简便、快速、准确、特异、敏感等优点，可作为猫冠状病毒全身性感染能力和毒力表型的基因分型方法，也可作为猫冠状病毒感染和排毒的检测方法，尤其适合作为猫传染性腹膜炎的临床排查和诊断的参考依据。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：