[发明专利]一种肝细胞体外共培养体系及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种肝细胞体外共培养体系及其构建方法与应用。一种肝细胞体外共培养体系，包括细胞外基质、肝细胞以及3T3‑J2成纤维细胞；所述的肝细胞种于所述的细胞外基质上，所述的肝细胞表面铺有所述的3T3‑J2成纤维细胞。所述的肝细胞体外共培养体系的构建方法如下：将3T3‑J2成纤维细胞接种在温度敏感性培养皿上，培养，剥离，得到。本发明提供的肝细胞体外共培养体系为人类肝细胞提供了一个更接近于体内肝组织微环境的立体形态，保证了紧密的肝细胞/肝细胞相互连接及肝细胞/支持细胞的相互作用，可以有效增强并维持肝细胞功能，进而可以用于长期药物评估。

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种肝细胞体外共培养体系及其构建方法与应用。

背景技术

药物性肝损伤是导致药物研发失败以及药物上市后被撤回的重要原因。由于动物与人的种属差异性，动物模型并不能保证准确预测药物在人体内的肝毒性。因此，建立稳定可靠的体外人类原代肝细胞模型并用于预测药物的肝毒性尤为重要。然而，人类原代肝细胞在普通二维体外培养过程中，由于缺乏体内肝脏的三维结构、细胞间相互作用以及生长因子的支持，会快速失去正常的形态和功能，从而导致肝细胞的药物代谢功能降低，进而影响其用于药物肝毒性筛选评估。因此，长期维持肝细胞的药物代谢功能是建立人类肝细胞模型所需要考虑的重要问题。

发明内容

为了克服现有肝细胞在二维体外培养过程中存在快速失去正常的形态和功能从而导致肝细胞的药物代谢功能降低的问题，本发明第一个方面的目的，在于提供一种肝细胞体外共培养体系。

本发明第二个方面的目的，在于提供上述肝细胞体外共培养体系的构建方法。

本发明第三个方面的目的，在于提供一种包括上述肝细胞体外共培养体系的试剂盒。

本发明第四个方面的目的，在于提供上述肝细胞体外共培养体系的应用。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供一种肝细胞体外共培养体系，包括细胞外基质、肝细胞以及3T3-J2成纤维细胞；所述的肝细胞种于所述的细胞外基质上，所述的肝细胞表面铺有所述的3T3-J2成纤维细胞。

所述的细胞外基质包括胶原、基质胶在内的所有天然类及合成类的细胞外基质；优选为胶原蛋白；更优选为鼠尾腱Ⅰ型胶原蛋白。

所述的肝细胞优选为永生化细胞系、原代细胞、衍生自多能干细胞中的至少一种；更优选为原代细胞。

所述的肝细胞的来源优选为人。

所述的3T3-J2成纤维细胞优选为3T3-J2成纤维细胞薄片。

所述的3T3-J2成纤维细胞薄片优选通过如下步骤得到：将3T3-J2成纤维细胞接种在温度敏感性培养皿上，培养，剥离，得到3T3-J2成纤维细胞薄片。

所述的3T3-J2成纤维细胞的接种数优选为120万～240万；更优选为150万～200万。

所述的温度敏感性培养皿优选为预涂胎牛血清的温度敏感性培养皿。

所述的预涂胎牛血清的温度敏感性培养皿优选通过如下方法得到：取胎牛血清加入温度敏感性培养皿，36～38℃过夜涂层，得到。

所述的培养优选依次包括第一次培养和第二次培养。

所述的第一次培养的条件优选为35～39℃、3％～7％CO₂浓度下培养3～5天；更优选为36～38℃、4％～6％CO₂浓度下培养3.5～4.5天；最优选为37℃、5％CO₂浓度下培养4天。

所述的第二次培养的条件优选为18～22℃下培养0.5～2.5h；更优选为20℃下培养1h-2h。