[发明专利]用于辅助前列腺癌早期筛查的尿液核酸标志物和检测试剂盒

说明书

本发明公开了用于辅助前列腺癌早期筛查的尿液核酸标志物和检测试剂盒，所述核酸标志物包括三种前列腺癌相关基因：T2E融合基因、PCA3基因和MMP‑2基因，以及两种内参基因：PSA基因和SPDEF基因。包含上述五种核酸标志物的多重荧光逆转录聚合酶链式反应（RT‑PCR）检测试剂，可用于辅助筛查前列腺癌，受试者工作特征（ROC）曲线的曲线下面积（AUC）可达0.81，灵敏度和阴性预测值分别可高达91.6%和93.3%。本发明的检测试剂盒操作简便，在一管试剂中完成多个核酸标志物的定量检测和前列腺癌筛查，可显著减少不必要的前列腺穿刺检查，具有良好的临床应用前景。

技术领域

本发明涉及分子生物学和医学诊断学领域，具体涉及用于辅助前列腺癌早期筛查的尿液核酸标志物和检测试剂盒。

背景技术

随着我国人口结构老龄化和人民生活习惯的改变，前列腺癌已悄然成为严重威胁我国男性健康的常见肿瘤之一。2018年的调查结果显示，我国前列腺癌患者的总数近14万5千人，最近5年的复合增长率高近10％，是发病率增长最快的肿瘤类型。前列腺癌若早期发现、及时治疗，五年生存率可达95％以上，而已发生转移的晚期前列腺癌，五年生存率不足30％。我国仅1/4～1/3的初诊患者属于早期的临床局限性前列腺癌，大多数患者初诊时已处于中晚期。与欧美发达国家相比，我国的前列腺癌早期诊断水平还有较大差距。

前列腺癌的筛查方法主要是血清前列腺特异抗原(PSA)的定量检测。PSA水平升高、且怀疑有前列腺癌风险的受试者，可通过前列腺穿刺检车作肿瘤确诊。PSA具有组织特异性，只在前列腺组织中表达，但不具有肿瘤特异性，前列腺炎症、良性增生等因素，都会造成PSA水平的异常。而前列腺细针穿刺检查的操作繁琐，受试者需预约住院，由医生行局部麻醉后，在超声引导下经会阴或直肠穿刺取样。血清PSA筛查前列腺癌的特异性不高，导致大量受试者接受了不必要的前列腺穿刺检查。因此，需要一种特异性更理想的筛查方法，优化前列腺癌的早期诊断流程。

研究显示，除血清PSA外，尿液中还有多个核酸标志物具有辅助前列腺癌筛查的潜力，这些标志物包括跨膜丝氨酸蛋白酶2-ETS转录因子相关基因的融合基因(T2E融合基因)、ETS转录因子相关基因(ERG基因)、前列腺癌抗原3基因(PCA3基因)、α-甲基酰基A辅酶消旋酶基因(AMACR基因)、基质金属蛋白酶2基因(MMP-2基因)、雄激素受体基因(AR基因)等。虽然使用单个标志物筛查前列腺癌的准确性还不够理想，但多个标志物联合使用，已表现出临床应用的可行性。专利CN104024436B、CN109161597B和CN110628908A分别介绍了血浆、血清、尿液等体液样本中多个核酸标志物联合筛查的方法，初步结果显示出良好的临床应用前景。

值得注意的是，上述专利方法的准确性，不仅与核酸标志物的选择有关，而且还取决于检测系统对检测偏差的克服。例如，为使不同样本之间的基因表达标准化，上述专利方法均设计了内参基因，通过评估待测基因与内参基因的相对表达水平，统一样本差异。然而内参基因并不能消除检测设备引入的偏差。例如，上述专利中各核酸标志物的定量系统分别在不同的检测管中工作，检测管与检测设备匹配程度的细微偏差，直接导致各检测系统的工作效率出现细微偏差，这种细微的偏差再经聚合酶链式反应指数倍放大后，将对检测结果造成不可忽视的影响。

另外，上述专利均使用了单个内参基因用于基因表达的校准，该设计在消除样本差异的同时，也有造成新的系统性偏差的风险。确保内参基因正常工作的前提是其表达量不能过低，当内参基因浓度较低时，操作过程(如外泌体富集、核酸纯化、模板加样等)引入的偏差将直接影响内参基因的定量数值，进而干扰核酸标志物的相对表达水平，导致筛查结果异常。

发明内容