[发明专利]一种用于检测土栖腐霉菌的LAMP引物组合物、试剂盒及其检测方法

说明书

本发明公开了一种用于检测土栖腐霉菌的LAMP引物组合物、试剂盒及其检测方法。一种用于检测土栖腐霉菌的LAMP引物组合物：正向内引物FIP如SEQ ID NO.1所示，反向内引物BIP如SEQ ID NO.2所示，正向外引物F3如SEQ ID NO.3所示，反向外引物B3如SEQ ID NO.4所示，正向环引物LF如SEQ ID NO.5所示,反向环引物LB如SEQ ID NO.6所示。本发明具备更高的准确性、灵敏度和实效性，而且操作方便、实用性好，为土栖腐霉菌的检测提供了新的技术平台，可用于土栖腐霉菌的高灵敏度快速检测。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测土栖腐霉菌的LAMP引物组合物、试剂盒及其检测方法。

背景技术

土栖腐霉菌(Pythium terrestris)属于卵菌纲(Oomycetes)、霜霉目(Perenosporales)、腐霉科(Pythiaceae)、腐霉属(Pythium)，可引起大豆的早衰和根系腐烂、坏死，在大豆生产中造成较重的经济损失。目前对该病害还没有有效的防治措施，加强检疫、防止病原菌的传播扩散是控制该病的最有效措施。为此应加强疫情监测，建立快速检测方法，为病害的风险及研究决策提供依据，从而有利于降低土栖腐霉菌引起的损失。

目前，针对土栖腐霉菌的检测技术较少。传统的检测方法主要是应用平板分离法和诱饵法，依据土栖腐霉菌的形态学进行鉴定。由于腐霉生长受温度影响形态不稳定，给检测带来了巨大困难。随着分子生物学的发展，特别PCR技术的普及，越来越多的分子生物学技术被应用到土栖腐霉菌的检测中。这些技术在特异性和灵敏度上有了较大的提高，但是检测时间仍然比较长，同时依赖精密的温度循环装置，检测过程复杂，不能满足快速检测的需求。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种新的核酸扩增技术，因其操作简单、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代PCR的新的核酸扩增技术。它是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60～65℃范围80min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物白色焦磷酸镁沉淀产生。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或有稳定热源的设备就能满足反应要求，检测成本大大降低。由于LAMP反应简单、快速、高效、经济等特征，因而具有极为广泛的应用前景。自LAMP检测技术建立14年以来，该技术已经广泛应用于对病毒、细菌、寄生虫、真菌等病原菌的检测研究，但在植物病原卵菌的检测报道很少，土栖腐霉的检测国内外均未见报道。

本发明通过序列比对分析土栖腐霉菌和其它腐霉菌在基因组序列上的差异，以PytM90基因序列为靶标设计了土栖腐霉菌特异性的LAMP引物组合物，在此基础上建立了土栖腐霉菌的LAMP快速检测方法。

发明内容

针对现有技术中土栖腐霉菌生物学检测方法所需周期长、检测方法特异性差、灵敏度低的问题，本发明的目的是提供一种用于检测土栖腐霉菌的LAMP引物组合物、试剂盒及其检测方法。

为了实现上述发明目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种用于检测土栖腐霉菌的LAMP引物组合物：正向内引物FIP如SEQ ID NO.1所示，反向内引物BIP如SEQ ID NO.2所示，正向外引物F3如SEQ ID NO.3所示，反向外引物B3如SEQ ID NO.4所示，正向环引物LF如SEQ ID NO.5所示,反向环引物LB如SEQ ID NO.6所示。

本发明所述的LAMP检测引物组合物在检测土栖腐霉菌中的应用。

本发明所述的LAMP引物组合物在制备检测土栖腐霉菌的试剂中的应用。