[发明专利]一种基因组编辑工具及其应用

说明书

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种基因组编辑工具及其应用。本发明的突变工具(enSc++)由广适Sc++基因在序列优化基础上进一步突变R221K/N404K两个关键功能位点进化而来，包含SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。本发明提供的植物基因组编辑工具可以在保持编辑靶点广适性的前提下明显提高剪切效率。本发明利用所述工具获得了水稻基因编辑突变体。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种基因组编辑工具及其应用。

背景技术

基因组编辑系统CRISPR-Cas9已成为医学研究中的一种非常重要的工具，并且最终可能在农业、生物能源和食品安全等领域产生重大影响。CRISPR-Cas9可通过短的RNA片段(即向导RNA,gRNA)引导到基因组上的不同位点，然后利用一种称为Cas9的DNA切割酶随后在改位点进行所需的编辑。然而，尽管这种基因编辑工具取得了相当大的成功，但是它在基因组上能够访问的位点数量仍然是有限的。这是因为CRISPR-Cas9需要一种称为前间隔序列邻近基序(protospacer adjacent motif，PAM)的特定DNA序列存在于基因组上的靶位点两侧，从而允许它识别靶位点。比如，作为一种最广泛使用的Cas9酶，来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9(SpCas9)的PAM序列为5′-NGG-3′。在这种PAM序列中，两个连续的碱基G的存在显著地限制了SpCas9能够靶向的位点数量，仅占基因组上的大约9.9％的位点，靶向区域十分局限。

现有技术中发现一种最成功的酶为来自犬链球菌(Streptococcus canis)的Cas9(ScCas9)，它与已经广泛使用的SpCas9酶非常相似。ScCas9是基础版SpCas9的变体，两者的氨基酸序列非常相似，但是它能够靶向SpCas9不能够靶向的靶DNA序列。ScCas9的PAM序列为5′-NNG-3′。在这种PAM序列中，仅存在一个碱基G，这就允许ScCas9要比SpCas9靶向基因组中更多的位点：占基因组中将近一半的位点。此外，ScCas9使用与SpCas9相同的gRNA。但ScCas9在植物基因编辑中效率相对偏低，基因组很多位点无法稳定编辑，因此对ScCas9及其衍生变体开展进一步效率优化，开发更加广适高效的植物基因组编辑工具十分必要。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基因组编辑工具及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明是这样实现的，一种基因组编辑工具，其特征在于：包含如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列或SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的同源序列；所述核苷酸序列由广适Sc++基因在序列优化基础上进一步突变R221K/N404K两个关键功能位点进化而来。

如上述的基因组编辑工具在基因组编辑中的应用。

进一步地，包括制备包含如权利要求1所述基因组编辑工具的表达载体、表达盒、打靶载体或转基因细胞中的至少一种。

进一步地，载体包括PUC57-AMP或pHUN400。

进一步地，包括在植物基因组编辑中的应用。

进一步地，所述植物包括单子叶植物。

进一步地，所述单子叶植物包括水稻。

进一步地，所述水稻包括粳稻。

进一步地，所述粳稻优选为粳稻日本晴。

一种植物基因组编辑方法，包括：

将包含如上述的核苷酸序列的片段与载体连接，获取包含编辑工具的植物表达载体；

将向导RNA的表达框与包含编辑工具的植物表达载体连接，获取包含sgRNA表达框的植物表达载体；