[发明专利]一种表皮干细胞的分离培养方法

权利要求书

1.一种表皮干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：

（1）取人皮片冲洗后，采用蛋白酶消化，分离表皮与真皮；

（2）消化表皮；

（3）用全培养基终止消化，离心重悬获得表皮干细胞单细胞悬液,所述全培养基的组成成分包括：DMEM和HamF-12，DMEM和HamF-12的比例为2-4:0.5-1.5，5%-15%FBS，15-25ng/mlEGF，4-8ug/ml 转铁蛋白，1.5×10^-4-2.0×10^-4mol/L腺嘌呤，3-6ug/ml 胰岛素， 8^-10-12^-10mol/L霍乱霉素，3-6ug/ml 氢化可的松；

（4）接种，培养箱中培养；

（5）去除滋养层细胞后，消化传代；

（6）检测。

2.根据权利要求1所述的一种表皮干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤（1）中人皮片面积大小为1~4cm²左右，厚度为0.5cm。

3.根据权利要求1所述的一种表皮干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤（1）中人皮片用含200mg/L青霉素、链霉素及2.5mg/L的无钙镁PBS反复冲洗。

4.根据权利要求1所述的一种表皮干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤（1）中蛋白酶为0.25%中性蛋白酶II，消化时间为30min。

5.根据权利要求1所述的一种表皮干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤（2）用胰蛋白酶和EDTA溶液消化表皮，消化30min或4℃过夜消化。

6.根据权利要求1所述的一种表皮干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤（3）终止消化时用含10%FBS的全培养基，用移液枪吹打3-5次，离心1000转/分，8~10分钟，弃上清，1000转/分重悬8~10分钟， 获得表皮干细胞单细胞悬液。

7.根据权利要求1所述的一种表皮干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤（4）将表皮干细胞单细胞悬液接种于丝裂霉素处理过的NIH₃T₃细胞滋养层上，37℃，5%CO₂培养箱中培养，初次培养一般在48h内贴壁。

8.根据权利要求1所述的一种表皮干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤（5）细胞长到80%融合时，用0.02%EDTA去除滋养层细胞后，0.25%胰蛋白酶和0.01%EDTA溶液消化传代。

9.根据权利要求1所述的一种表皮干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤（6）用免疫荧光、免疫组化及RT-PCR的方法检测特异分子标记。