[发明专利]一种表皮干细胞的分离培养方法

说明书

本发明公开了一种表皮干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：（1）取人皮片冲洗后，采用蛋白酶消化，分离表皮与真皮；（2）消化表皮；（3）终止消化，离心重悬获得表皮干细胞单细胞悬液；（4）接种，培养箱中培养；（5）去除滋养层细胞后，消化传代；（6）检测。本申请的表皮干细胞分离与培养方法是一种能够提高表皮干细胞活性和增殖能力的体外培养方法，且方法简单，方便操作，省时省力。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是一种表皮干细胞的分离培养方法。

背景技术

皮肤是人体最大的器官,在抵御微生物入侵、紫外线辐射及防止水分的丢失、调节体温上起重要作用，同时也是免疫系统的组成部分之一。除了这些生物学功能外，皮肤在维持人的外貌上还起十分重要的作用。表皮是典型的能够自我更新的组织，在哺乳类动物体内已分化的组织中表皮组织占60%，它们功能强大，分泌生物活性物质，吸收营养，保持组织的完整性。皮肤外层的表皮终身不断自我更新，其基底部的干细胞持续增殖分化以取代外层终末分化细胞，从而进行组织结构的更新，外层细胞的死亡脱落与基底干细胞的分裂维持一定的平衡，这是维持正常的组织结构和细胞内环境稳定的基本要求。

表皮干细胞是一种具有产生至少一种以上高度分化子代细胞潜能的细胞。从发生机制来看，干细胞并不直接分化产生终末分化细胞，而是先分化成短暂扩充细胞，短暂扩充细胞有产生定向分化成某种终末分化细胞的能力，因而是定向祖细胞。

但目前对表皮干细胞的体外培养尚不成熟。因此，探索一种能提高表皮干细胞活性和增殖能力的体外培养方法，已成为本领域技术人员急需解决的技术问题。

发明内容

针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种表皮干细胞的分离培养方法，适用于表皮干细胞的体外培养，培养速度快，耗时短，操作简单，为科研领域提供一种全新的培养方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种表皮干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：

（1）取人皮片冲洗后，采用蛋白酶消化，分离表皮与真皮；

（2）消化表皮；

（3）终止消化，离心重悬获得表皮干细胞单细胞悬液；

（4）接种，培养箱中培养；

（5）去除滋养层细胞后，消化传代；

（6）检测。

优选的是，步骤（1）中人皮片面积大小为1~4cm²左右，厚度为0.5cm。

上述任一方案优选的是，所述步骤（1）中人皮片用含200mg/L青霉素、链霉素及2.5mg/L的无钙镁PBS反复冲洗。

上述任一方案优选的是，所述步骤（1）中蛋白酶为0.25%中性蛋白酶II，消化时间为30min。

上述任一方案优选的是，所述步骤（2）用胰蛋白酶和EDTA溶液消化表皮，消化30min或4℃过夜消化。

上述任一方案优选的是，所述步骤（3）终止消化时用含10%FBS的全培养基，用移液枪吹打3-5次，离心1000转/分，8~10分钟，弃上清，1000转/分重悬8~10分钟， 获得表皮干细胞单细胞悬液。

上述任一方案优选的是，所述全培养基的组成成分包括：DMEM和HamF-12，DMEM和HamF-12的比例为2-4:0.5-1.5，5%-15%FBS，15-25ng/ml EGF，4-8ug/ml 转铁蛋白，1.5×10^-4-2.0×10^-4mol/L腺嘌呤，3-6ug/ml 胰岛素， 8^-10-12^-10mol/L霍乱霉素，3-6ug/ml 氢化可的松。