[发明专利]一种用于治疗白菜软腐病的药物的筛选方法有效
申请号: | 202010607382.X | 申请日: | 2020-06-30 |
公开(公告)号: | CN111718923B | 公开(公告)日: | 2022-09-27 |
发明(设计)人: | 黄迎春;方国康;李若慧;张元 | 申请(专利权)人: | 北京联合大学 |
主分类号: | C12N9/80 | 分类号: | C12N9/80;C12N15/70;G01N21/64;G01N33/53 |
代理公司: | 北京北新智诚知识产权代理有限公司 11100 | 代理人: | 张晶 |
地址: | 100101 *** | 国省代码: | 北京;11 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 用于 治疗 白菜 软腐 药物 筛选 方法 | ||
本发明提供一种用于治疗白菜软腐病的药物的筛选方法,包括如下步骤:质粒构建,蛋白诱导表达,蛋白分离纯化,蛋白的荧光淬灭反应筛选化合物,确定化合物的最佳抑菌浓度。本发明提供的方法通过荧光光谱法筛选与白菜软腐病菌关键蛋白结合的配体分子,从而得到可治疗白菜软腐病的药物。
技术领域
本发明属于植物保护领域,涉及一种植物病的药物的筛选方法,具体涉及一种用于治疗白菜软腐病的药物的筛选方法。
背景技术
大白菜在食用的蔬菜中占较大比例,自古以来就有“蔬菜之王”的美称,是各地市场销量大且价格看好的蔬菜之一。但软腐病一直是制约大白菜大面积发展和收储的关键因素。白菜软腐病,又叫腐烂病、烂疙瘩、烂葫芦、烂葫芦头病、水烂病、脱帮子,是大白菜生产中一种毁灭性病害,如果发生,可成片绝收。主要为害叶片、柔嫩多汁组织及茎或根部。初呈水浸状或水浸半透明,后变褐软化腐烂,病部渗出黏液,散出臭味。该病不仅在白菜生长后期危害,而且在贮藏期间可继续扩展危害,造成烂窖。
最初发病于接触地面的叶柄和根尖部,叶柄发病部位呈水渍状,外叶失去水分而萎蔫,最后整个植株枯死。生长后期发病时,首先出现水渍状小斑点,叶片半透明,呈油纸状,最后整株软化、腐烂,散发出特殊的恶臭。黄条跳甲、甘蔗黑蟋蟀等虫害严重时,病菌从伤口处大量侵入,导致病害加重。有时,在运输途中发生软化腐烂现象。
造成白菜软腐病的病菌为胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种PC1菌株(Pectobacterium carotovorum subsp.Carotovorum PC1),是植物细菌性软腐病的主要致病菌,常危害胡萝卜、白菜、马铃薯等植物。除此之外,在北京市顺义区的芹菜软腐病、南京市八卦洲的芦蒿软腐病、甘肃省嘉峪关市的洋葱鳞茎软腐病、山西市晋中的西葫芦软腐病等病害样品中都分离到PC1菌株,说明病原菌宿主范围极广,并带来巨大的经济损失。
为了有效的控制白菜软腐病病害的发生,亟待筛选和发现新型治疗白菜软腐病的药物。
发明内容
为了解决上述问题,本发明的目的在于提供一种用于治疗白菜软腐病的药物的筛选方法,该方法通过荧光光谱法筛选与白菜软腐病菌关键蛋白结合的配体分子,从而得到可治疗白菜软腐病的药物。
为了实现上述目的,本发明提供一种用于治疗白菜软腐病的药物的筛选方法,包括如下步骤:
1)质粒构建:将胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种PC1菌株的N琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶的如Seq ID No.1所示的核苷酸序列插入到带有T7启动子的大肠杆菌原核表达载体pET28a的Nde1和Xho1酶切位点之间,得到pET28a-PccdapE质粒;
2)PccDapE蛋白诱导表达:将pET28a-PccdapE质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,LB培养基37℃培养至OD600在0.6~0.8之间;加入IPTG至浓度为0.1mM,12℃,200rpm条件下,诱导培养48h;
3)使用镍离子螯合树脂柱分离纯化PccDapE蛋白;
4)向PccDapE蛋白溶液中添加待选化合物进行荧光淬灭反应;
5)选择可与PccDapE蛋白发生荧光淬灭反应的化合物配制成梯度浓度的化合物溶液,与大白菜软腐病菌菌液混合,28℃,150rpm摇床培养24h,通过分光光度计确定化合物的最佳抑菌浓度。
优选地,所述步骤4)中荧光淬灭反应的荧光激发波长为280nm;激发和发射狭缝均为5nm,在荧光光度计上记录290~500nm波长范围内的发射光谱。
本发明还提供一种采用上述方法筛选得到的TBFC作为抑制白菜软腐病菌生长的药物的用途。
本发明的有益效果在于:
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