[发明专利]人体液中PNS或AE自身抗体检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.人体液中PNS或AE自身抗体检测试剂盒，其特征在于，包括试纸条、样品稀释液、二抗、洗涤液和显色剂；

所述的试纸条包括垫板、设置有对照点和检测点的载体膜、吸水垫和样品垫；所述的载体膜检测点上固化有靶抗原Ag，Ag表示PNS或AE疾病自身抗体对应的靶抗原中的某一抗原；对照点上固化有阴性对照抗原；所述的吸水垫、载体膜和样品垫均铺设在垫板上，吸水垫设置在载体膜对照点端，样品垫设置在载体膜检测点端；

所述样品稀释液由工作液和封闭蛋白液按照体积比为5:1～15:1的比例混合而成；

所述的工作液为1×PBS或1×TBS或100mM磷酸钠盐缓冲液、0.5％～1％Triton X-100或0.5％～1％Tween-20、0.02％～0.05％EDTA的混合液，工作液的pH＝6.8～7.2；

所述的封闭蛋白液通过以下方法制备得到：

将pET28a-GST或pET28a质粒载体转化至大肠杆菌中，得到含有pET28a-GST或pET28a质粒的菌体；将含有pET28a-GST或pET28a质粒菌体的菌液离心处理，所得上清液中加入破菌液，超声破碎15～35min后离心处理，取上清液，加入5％～10％BSA、2％～5％PEG12000和1×蛋白酶抑制剂，得到蛋白封闭液。

2.如权利要求1所述的人体液中PNS或AE自身抗体检测试剂盒，其特征在于，该检测试剂盒中还包括洗涤液，所述的洗涤液为50～80mM Tris-HCl、0.8％～1％NaCl、0.5％～1％Triton X-100的混合液或50～80mM Tris-HCl、0.8％～1％NaCl、0.5％～1％Tween-20的混合液，洗涤液的pH＝8.2～8.5。

3.人体液中PNS或AE自身抗体检测材料的制备方法，该方法用于获取权利要求1或2中靶抗原Ag，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，获取靶抗原Ag的CDS序列作为目的基因，将带有酶切位点的目的基因插入pET28a质粒载体中，得到重组质粒载体pET28a-Ag；Ag表示PNS或AE疾病自身抗体对应的靶抗原中的某一抗原；

步骤2，将重组载体pET28a-Ag转化至大肠杆菌中，得到含有靶抗原Ag的菌体；

步骤3，采用亲和层析法对步骤2得到的含有靶抗原Ag的菌体进行纯化；

步骤4，将经过步骤3纯化后的产物进行验证，将验证无误后的靶抗原Ag固化在载体膜上，得到人体液中PNS或AE自身抗体检测材料。

4.如权利要求3所述的人体液中PNS或AE自身抗体检测材料的制备方法，其特征在于，步骤3中亲和层析法纯化过程包括：

步骤3.1，向步骤2得到的含有靶抗原Ag的菌体中加入破菌液，震荡涡旋后超声破碎15～35min，于4-8℃离心20～30min，所得上清即为初始样品液；

其中，菌液：破菌液的体积比为20:1；His标签抗原对应的破菌液为20mM Tris-HCl、10～200mM NaCl和10～100mM咪唑的混合液，破菌液的pH＝7.4～9.0；GST标签抗原对应的破菌液为1×PBS；

步骤3.2，用去离子水清洗亲和层析柱，再用破菌液平衡10～30倍柱体积，向平衡好的亲和层析柱中加入步骤3.1的初始样品液，4℃结合1～2小时；

步骤3.3，用第一缓冲液洗涤步骤3.2得到的亲和层析柱10～30倍柱体积，用第一洗脱液对洗涤后的预装柱进行梯度洗脱，收集洗脱液，将洗脱液通过脱盐处理，得到纯化后的靶抗原Ag；

其中，His标签抗原对应的第一缓冲液为20mM Tris-HCl和100～1000mM NaCl混合液，第一缓冲液的pH为7.4～9.0；GST标签抗原对应的第一缓冲液为1×PBS；

His标签抗原对应的第一洗脱液为20mM Tris-HCl和10～1000mM咪唑的混合液或20mMTris-HCl和10～300mM Glu的混合液；GST标签抗原对应的第一洗脱液为50mMTris-HCl、10～100mM还原型谷胱甘肽的混合液，第一洗脱液pH为8.0。

5.如权利要求3所述的人体液中PNS或AE自身抗体检测材料的制备方法，其特征在于，在步骤3纯化的基础上还可采用离子交换层析法、疏水层析法或凝胶过滤层析法进行进一步纯化。