[发明专利]一种苯丙氨酸脱氢酶及其制备方法与用途

说明书

本发明公开了一种苯丙氨酸脱氢酶及其制备方法与用途。涉及菌株培养、酶表达与分离纯化、酶的离子液体耐受性和有机溶剂体系耐受性的检测等。本发明获得了一种工业生物催化应用所需的耐有机溶剂、耐离子液体的高稳定性苯丙氨酸脱氢酶，该酶具有在非水相体系中抗逆性较好、稳定性较高的特性，在工业生产中能够有效延长半衰期，提高催化效率，达到降低生产成本的目的，具有重要的工业应用价值。

技术领域

本发明属于新型生物催化剂技术领域，具体涉及极端氨基酸脱氢酶及其制备方法与用途，涉及氧化还原酶的耐有机溶剂、耐离子液体等抗逆性能，以及在非水相体系中催化非天然氨基酸的能力，属于新型生物催化剂挖掘领域。

背景技术

氧化还原酶是六大酶类中所占比重最大的一类，广泛应用于精细化学品和药物的生产、医疗诊断试剂盒、辅酶再生体系、生物感应器以及污染物生物降解等。其中NADH或NADPH依赖型氧化还原酶在手性合成中有着重要的作用，例如催化醛、酮、羰基以及烯烃碳碳双键的还原，使许多潜手性物质转化为手性产品应用于医药、食品、精细化工等领域。目前氧化还原酶研究内容主要集中于酶的分离鉴定、底物特异性和立体选择性等催化性能，而对其具有工业应用属性的抗逆性能关注较少。

为了克服疏水性底物或产物溶解度低等限制，添加非水相介质作为共溶剂是工业上疏水性化合物生物转化工艺中普遍采用的方法。非水相酶催化具有提高底物溶解性、减少副反应以及调节酶的特异性等优势。因此，非水相酶催化技术在手性及药物合中间体成、精细化学品和生物能源生产等领域日益受到关注。目前，非水相生物催化技术的研究一方面集中在发现和筛选溶剂耐受性生物催化剂。例如，从嗜极生物中获得具有耐受性的生物催化剂。嗜极生物是指可以或者需要在极端环境中生存的生物，而部分生命体能在两种或两种以上的极端环境条件下生存，因此存在多种极端环境兼性嗜极生物，例如嗜热嗜盐、嗜热嗜酸、嗜热嗜碱、嗜冷嗜碱、嗜盐嗜碱微生物等。从这些微生物中可以挖掘获得具有特殊催化性能的生物催化剂。例如，来自嗜极生物的不同极端酶(extremozymes)可在高盐、高压、高热、低温、极酸或极碱等条件下起作用，如嗜盐酶表面负电荷的作用表现在两方面，一是表面羧基促进酶在高盐条件下的溶解，二是负电荷的静电斥力抵消了高盐条件造成的疏水效应，从而使其可在高盐浓度下保持稳定。因此，具有耐有机溶剂、耐离子液体等抗逆性能，以及能在非水相体系中催化的极端酶具有重要的工业应用价值，而其中具有耐受有机溶剂、耐离子液体的氧化还原酶是该领域研究的前沿热点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种苯丙氨酸脱氢酶及其制备方法与用途，涉及酶耐有机溶剂、耐离子液体的性能和催化非天然氨基酸的能力生物催化领域。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：

一种苯丙氨酸脱氢酶，所述苯丙氨酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述苯丙氨酸脱氢酶的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述苯丙氨酸脱氢酶来源于Natranaerobius thermophilus(DSM 18059T)；所述苯丙氨酸脱氢酶的基因来源于其基因组中的片段。

所述苯丙氨酸脱氢酶为NADH或NADPH依赖型氧化还原酶。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：

一种苯丙氨酸脱氢酶的制备方法，包括：1)表达所述苯丙氨酸脱氢酶的重组表达菌株的制备；2)粗酶液的制备；3)纯酶制备。

进一步地，所述步骤1)包括：根据如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，采用基因合成的方法获得含目标酶的基因序列，与载体pET28a连接，得到pET28a-PheDH质粒；将所述pET28a-PheDH质粒转化至E.coli BL21(DE3)，得到可表达带His-tag标签的苯丙氨酸脱氢酶的重组表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a。