[发明专利]一株猪繁殖与呼吸综合征病毒1型分离株感染性克隆构建、拯救与应用

说明书

一株猪繁殖与呼吸综合征病毒1型分离株感染性克隆构建、拯救与应用，本发明提供一株猪繁殖与呼吸综合征病毒1型（PRRSV1）野毒株的感染性克隆病毒，为研究PRRSV1的Marc‑145细胞适应性决定因素提供关键遗传操作平台。同时，针对目前我国缺乏PRRSV1疫苗的实际问题，本发明的PRRSV1野毒株感染性克隆平台，还可用于研制更加安全高效的新型PRRSV1基因工程疫苗。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一株猪繁殖与呼吸综合征病毒1型 毒株感染性克隆构建、拯救、改造及其应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndromevirus, PRRSV)在全世界养猪国家中广泛流行。PRRSV感染主要引起母猪流产以及整 个猪群的呼吸道症状。PRRSV可分为两个基因型(PRRSV1和PRRSV2)和多个 基因亚型。1995年，我国首次出现PRRSV2并迅速在全国传播。2006年，我国 暴发高致病性PRRSV2变异株(HP-PRRSV)引起的“猪高热病”。此外，近几年 PRRSV1野毒株也陆续在我国香港、内蒙古、黑龙江、辽宁、福建、贵州等省市 分离。

PRRSV是一种单股正链RNA病毒，属于套式病毒目动脉炎病毒科。PRRSV 基因组大小约为15kb，5’端有帽子结构，3’端有Poly(A)尾，中间有10个开放 阅读框(ORF)。ORF1a和ORF1b编码至少16个非结构蛋白，在病毒复制和转 录中发挥重要作用。ORF2-7编码8个结构蛋白用以构成感染性病毒粒子。

我国同时存在PRRSV1和PRRSV2分离株，而且PRRSV1和PRRSV2毒株 又可分为多个亚型。基于某一基因亚型毒株研制的商品化疫苗可有效防控同源型 PRRSV野毒株感染引发的繁殖障碍与呼吸道症状，但其交叉保护性差。尽管近 几年PRRSV1不断在中国猪群分离，但现有中国PRRS疫苗均为2型PRRS疫苗。 因此，急需研制对抗我国PRRSV1感染的新型特异性疫苗。然而，由于我国现有PRRSV1分离株只能在原代肺泡巨噬细胞PAM，无法在传代Marc-145细胞上培 养。成为研制PRRSV1传代活疫苗的一大难题。

RNA病毒感染性克隆是通过体外构建病毒cDNA克隆，在DNA水平上对病 毒基因进行人工操作，再通过体外拯救出感染性病毒粒子。PRRSV1感染性克隆 的成功构建与遗传操作可用于新型基因工程疫苗研制。尽管前人研究中已经建立 了PRRSV反向遗传操作平台，然而，基于我国PRRSV1野毒株的反向遗传操作 平台至今未有报道。

发明内容

针对我国PRRSV1野毒株难以在传代Marc-145细胞上体外培养的科学问题， 本发明提供一株猪繁殖与呼吸综合征病毒1型(PRRSV1)野毒株的感染性克隆 病毒，为研究PRRSV1的Marc-145细胞适应性决定因素提供关键遗传操作平台。 同时，针对目前我国缺乏PRRSV1疫苗的实际问题，本发明的PRRSV1野毒株 感染性克隆平台，还可用于研制更加安全高效的新型PRRSV1基因工程疫苗。

本发明是通过以下技术方案实现的：

在本发明的一个方面，提供了一种重组载体，包含PRRSV1基因组全长cDNA 序列，该全长cDNA序列的5’端加有巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)真核 启动子序列，3’端Poly(A)尾下游加有丁肝炎病毒核酶(Hepatitis D virus ribozyme) 序列以及牛生长激素多聚腺苷酸信号(Bovine Growth Hormone(BGH) polyadenylation signal)转录终止序列。

本发明优选的载体为pACYC177低拷贝载体。经过基因合成和同源重组等方 法在pACYC177载体上插入五个单一限制性酶切位点(SgsI,Pfl23II,BglII， Bsp1407I和XbaI)用于PRRSV1弱毒株HLJB1的感染性克隆构建。